YBX1 promotes type H vessel–dependent bone formation in an m5C-dependent manner

《JCI Insight》（IF=8.000）

RNA结合蛋白（rbp）与RNA相互作用，并在其生命周期中广泛调节RNA转录本，在血管生成相关疾病的进展中起着重要作用。

在骨骼系统中，内皮依赖的血管生成对骨形成是必不可少的。然而，rbp在内皮依赖性骨形成中的作用尚不清楚。

在这里，我们发现RBP-y-box结合蛋白1（YBX1）在卵巢切除术（OVX）小鼠的骨血管系统中显著减少。内皮细胞特异性缺失Ybx1损害CD31高、内粘蛋白高（CD31hiEMCNhi）内皮形态，导致低骨量，而Ybx1过表达促进血管生成依赖的骨生成并改善骨丢失。

在机制上，YBX1缺失以m5c依赖的方式破坏了CD31、EMCN和骨形态发生蛋白4（BMP4）的稳定性，并阻断了内皮来源的BMP4的释放，从而抑制了骨间充质间质细胞的成骨分化。

给予重组BMP4蛋白可恢复Ybx1缺失小鼠受损的骨形成。尾静脉注射携带CD31修饰的聚乙二醇聚（乳酸共乙醇酸），一种天然的YBX1激动剂，在药物上部分逆转CD31hiEMCNhi血管的下降，改善了OVX和衰老动物的骨量。

这些发现证实了RBP-YBX1在血管生成依赖的骨形成中的作用，并为改善骨质疏松症提供了一种治疗方法。

为研究Ybx1在OVX小鼠骨内皮中的表达，我们采用OVX来研究病理条件下的情况。micro-CT和组织形态学分析显示，与假对照组相比，OVX小鼠的骨量和骨小梁厚度显著减少。

流式细胞仪定量和免疫荧光检测显示，与sham组相比，OVX小鼠的CD31hiEMCNhi内皮细胞（ECs）明显减少，CD31和EMCN染色较弱（图1，F和G）。

同时RT-qPCR分析，发现OVX小鼠中Ybx1的表达降低。免疫荧光显示YBX1的表达略低。这些观察结果表明，YBX1蛋白在OVX小鼠模型中是动态控制的。

为进一步鉴定HUVECs中受YBX1调控的潜在促血管生成因子，我们进行了RNA-Seq转录谱分析。

GO分析显示，与对照组相比，ybx1基因敲除组中血管生成和成骨相关的差异表达基因被富集，并构成了前15个GO类别。

RT-qPCR数据进一步证实，YBX1敲低降低了促血管生成基因的水平，而抗血管生成基因的表达上调。

这些结果提示Ybx1在血管生成中起关键作用，并可能参与了OVX小鼠的骨内皮功能障碍。

为了进一步揭示Ybx1在骨内皮中的作用，我们构建消融Ybx1（Ybx- 1iΔEC）的Ybx1突变小鼠。流式细胞术数据显示，Ybx1iΔEC型干骺端的H型ECs明显减少与同窝对照组。

对Ybx1iΔEC突变体的免疫荧光分析显示有明显的血管缺陷，VEGFA免疫染色进一步支持了这一表型。

为了验证Ybx1iΔEC突变小鼠骨内皮的破坏是否由雌激素驱动，我们检测了血清雌二醇水平。与同窝对照组相比，Ybx1iΔEC组的血清雌二醇水平没有变化。

显微ct和组织形态测量学分析显示，Ybx1iΔEC小鼠有严重的骨质疏松表型，在4周大的Ybx1iΔEC小鼠中，骨祖细胞显著下降，与骨血管共偶联。

这些发现表明，内皮细胞Ybx1缺失引起H型内皮形成和骨形成的损伤，而它激活骨吸收。

接下来，我们进行了一个体内实验来评估ec特异性Ybx1过表达对OVX诱导的骨丢失的影响。将重组腺相关病毒（rAAV）2/9 sup-Tie1-Ybx1-GFP注射到小鼠体内。

免疫染色显示，EMCN/CD31的红色荧光与GFP的绿色荧光有很大的重叠，说明GFP的rAAV2/9病毒表达将特异性靶向ECs。

流式细胞仪定量分析证实了OVX诱导的CD31hiEMCNhi ECs的减少，而在Ybx1iOE-EC小鼠中EC数量的增加。

同样，股骨切片的免疫染色显示Ybx1iOE-EC部分挽救了OVX诱导的CD31hiEMCNhi内皮丰富度的下降，以及柱/弓模式和丝状伪足延伸的缺陷。

此外，用AAV2/9 sup-Tie1-Ybx1处理的OVX小鼠的VEGFA密度也被有效地恢复了。显微ct分析显示，AAV2/9sup-tie1-Ybx1注射液显著挽救了OVX小鼠的骨丢失。

同样，在AAV2/9 sup-Tie1-Ybx1治疗后，OVX小鼠股骨干骨端Ocn+成骨细胞数量的减少也部分得到了改善。钙黄绿素双标记也显示，骨小梁MAR和BFR在OVX小鼠中可以被有效地恢复。

这些数据表明，在ec中过表达Ybx1的AAV2/9可部分逆转OVX小鼠的血管生成和成骨缺陷以及破骨细胞生成的异常激活。

为了区分YBX1的直接和间接血管生成和成骨相关靶点，我们进行了CLIP-Seq。数据分析发现有相当一部分的峰被映射到3‘-UTR区域。

在284个YBX1 CLIP-Seq靶点中有64个共同靶点在RNA-Seq和CLIPSeq数据之间重叠。最显著富集的靶基因涉及血管生成，包括促血管生成基因-ANGPT2、CD31、EMCN、RUNX1和THBS1。

提示YBX1通过调节促血管生成基因的表达来影响ec的血管生成。大多数峰聚集在一个特定的区域，这意味着多个ybx1结合事件参与了调控pre-mRNA的剪接。

先前的研究报道，YBX1通过与3‘-UTR结合来调节mRNA的稳定性。我们接下来通过识别基因特异性基序来关注3‘-UTR区域聚集的ybx1结合事件基序上的峰。

数据显示，大多数CLIP簇富含cc的六聚体。CLIP-Seq分析显示，YBX1在CD31和EMCN的3‘-UTR上有明显更高的峰分布。

为了进一步评估YBX1是否与3个靶点‘3’-UTR结合，我们进行了m5C RIP，发现YBX1在m5C RIP上与CD31和EMCN 3‘-UTR结合，但没有发现IgG免疫复合物。RNA下拉分析，验证了这一结果。

接下来，我们确定了ybx1结合的m5C位点在调节3‘-UTR激活中的具体作用。YBX1显著激活了WT3‘-UTR的荧光素酶活性，但没有激活MUT3’-UTR，进一步证明了YBX1通过m5C修饰与其3‘-UTR特异性结合来调节mRNA水平。

我们用shYBX1和shControl感染HUVECs2天，然后用放线菌素D治疗不同时间。RT-qPCR结果显示，BMP4 mRNA水平为与放线菌素D组相比，快速处理后，表达shYBX1的HUVECs的相对CD31 mRNA半衰期、EMCN mRNA半衰期明显降低。

此外，YBX1基因敲低显著降低了CD31和EMCN蛋白的表达。因此，我们发现YBX1的缺失通过以m5c依赖的方式破坏CD31和EMCN mRNA的稳定性，从而损害了血管生成。

体外细胞实验发现与对照组小鼠相比，原代ECs的培养基上清液显示出诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的能力增强。

这些结果表明，内皮细胞和骨髓间充质干细胞之间存在明显的血管衍生因子串扰。

为了确定Ybx1在ECs中调控的潜在因子，我们从RNA-Seq和CLIP-Seq数据中筛选了共同的靶点，并确定了BMP4。

免疫荧光染色和定量分析显示，与同窝对照组相比，Ybx1iΔEC小鼠的Bmp4表达显著降低。

此外，我们发现Bmp4在骨内皮中表达，这强烈表明Bmp4是耦合血管生成和骨髓间充质干细胞分化的潜在血管来源因子。

我们用Bmp4重组蛋白处理原代骨髓间充质干细胞，并诱导成骨和成脂分化。RT-qPCR分析显示，BMP4处理骨髓间充质干细胞导致Alp、Ocn和Runx2转录本上调，Fabp4和Ppargγ以浓度依赖的方式下调。

同时，用Ybx1iΔEC小鼠原代骨髓间充质干细胞的培养基处理后，骨髓间充质干细胞成骨减少，脂肪生成增强。在培养基中加入BMP4重组蛋白可以逆转这种作用。

接下来，BMP4重组蛋白每天注射到Ybx1iΔEC小鼠中4周，给予BMP4重组蛋白拯救的结构改变Ybx1iΔEC干骺端和骨血管系统，减少骨髓脂肪积累，使小梁形成。

我们的数据表明，骨血管来源的因子BMP4积极参与了内皮细胞Ybx1对骨血管生成和成骨生成的耦合作用。

我们认为增强Ybx1的表达可能是缓解OVX诱导的H型血管丰富度减少和骨量损失的潜在治疗策略。对ec细胞进行细胞增殖实验，TF2A和紫杉双黄酮增强了HUVECs的细胞活力。

Westernblot结果显示，用紫杉双黄酮治疗HUVECs可导致YBX1及其靶基因CD31、EMCN和BMP4的表达上调。这与紫杉双黄酮通过阻断泛素化介导的蛋白降解途径来增强YBX1的稳定性的研究结果相一致。

我们将CD31抗体（AlexaFluor488）偶联到聚（乳酸共乙醇酸）（PLGA）nh2-聚乙二醇（NH2-PEG）上，以靶向ECs，构建了一个纳米载体。

尾静脉注射cd31标记的NPs，用cd31标记的NPs处理的OVX小鼠的骨量、成骨细胞数量和骨祖细胞数量显著增加。

破骨细胞数量显著减少。此外，流式细胞仪定量显示，与OVX对照小鼠相比，H型ECs显著增加）。CD31标记的NP处理导致了OVX小鼠中CD31hiEMCNhi ECs的大量扩增。

同样，VEGFA和BMP4的荧光强度显著增加，这些结果提供了证明cd31标记的紫杉双黄酮NPs可能可以改善低骨量疾病，如绝经后骨质疏松症。

接下来，为了确定紫杉双黄酮对衰老雄性和雌性小鼠内皮形成和骨形成的治疗作用，将cd31标记的NPs注入20月龄雌性小鼠。

流式细胞术分析显示，使用CD31标记的NPs可以显著对抗年龄诱导的CD31hiEMCNhi内皮丢失。

Westernblot结果显示，CD31标记的NPs激活了CD31hiEMCNhiec中YBX1的表达，micro-CT显示，cd31标记的NP治疗促进了骨形成，增加了成熟成骨细胞数量，减少了骨髓脂肪积累，以及破骨细胞数量。

接下来，我们用cd31标记的NPs治疗20个月大的雄性小鼠，与对照组小鼠相比，CD31hiEMCNhiECs的密度、VEGFA和BMP4荧光强度以及Osterix+骨祖细胞数量均有类似的改善。

这些结果表明，在老年和OVX诱导的骨质疏松小鼠模型中，静脉注射坐骨素提高Ybx1的表达可促进CD31hiEMCNhi血管的形成，并刺激新骨的形成。

总之，我们发现YBX1作为一种RBP，通过与骨髓间充质干细胞的分化结合，促进H型血管依赖的骨形成。

携带cd31修饰的含衰老素的NPs可用于促进老年和OVX小鼠H型血管的形成和成骨。

我们在这里提出的发现为通过促进血管生成依赖的成骨来管理骨质疏松性疾病状态的新治疗方法奠定了基础。

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