Positive feedback loop of c-myc/XTP6/NDH2/ NF-κB to promote malignant progression in glioblastoma
《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》
（IF=11.3997）
背景：
最近的研究强调了NF-κB信号通路在癌症的起始和进展中的重要作用。此外，长链非编码rna（lncRNAs）已被确定为维持NF-κB信号通路功能的关键调控因子。
尽管有这些发现，lncrna影响NF-κB通路的潜在分子机制仍在很大程度上尚未被探索。
方法：
采用生物信息学分析方法研究XTP6的差异表达和预后意义。通过体外和体内实验的方法进一步阐明了XTP6的功能作用。
为了评估XTP6和NDH2之间的相互作用，我们进行了RNA下拉和RNA免疫沉淀（RIP）分析。使用RNA纯化（ChIRP）染色质分离法检测XTP6和IκBα启动子之间的连接。
此外，采用染色质免疫沉淀（ChIP）分析c-myc与XTP6启动子的结合亲和力，为其调控机制提供见解。
结果：
XTP6在多形性胶质母细胞瘤（GBM）组织中显著上调，并与GBM患者的不良预后有关。我们的研究显示，XTP6在体内外均能促进GBM的恶性进展。
此外，XTP6通过将NDH2招募到IκBα启动子上，下调IκBα的表达，导致H3K27me3水平升高，从而降低IκBα的转录活性。
此外，c-myc介导的XTP6的上调进一步驱动了GBM的进展，与IκBα建立了一个正反馈回路，使NF-κB信号通路的激活持续下去。
值得注意的是，一种靶向NF-κB信号通路的抑制剂的应用有效地抑制了XTP6诱导的持续激活，导致体内肿瘤形成的显著减少。
结论：
结果显示，XTP6揭示了一种创新的表观遗传机制，有助于NF-κB信号通路的持续激活，为GBM的治疗提供了一个很有前途的治疗靶点。
我们对XTP6的表达进行了泛癌分析。GBM组织中XTP6的表达水平明显高于相应的正常组织。在CGGA（图1B）和GSE16011数据集中，GBM中XTP6的表达水平明显高于正常脑组织（NBT）。
生存分析结果显示，在CGGA和GSE16011数据集中，XTP6高表达亚组的GBM患者的预后明显低于低XTP6表达亚组。
随后，RNA-ISH分析，发现XTP6在GBM组织中的表达水平明显高于PCTs。qRT-PCR实验分析XTP6在GBM组织中的表达水平明显高于PCTs。
XTP6在GBM细胞系中的表达量明显高于NHA细胞系，且XTP6在U251MG和U118MG中的表达量均最高。
我们的研究结果显示，在U251MG和U118MG细胞中，XTP6同时存在于细胞核和细胞质中。综上所述，XTP6是一个重要的致癌基因，与GBM的不良预后有关。
为了确定XTP6是否参与了GBM的恶性进展，我们进行了细胞功能实验。CCK-8检测结果显示，下调XTP6后，U118MG和U251MG细胞活力明显下降，而过表达U11P6导致U118MG和U251MG细胞活力均增加。
集落形成实验显示，与NC相比，XTP6基因敲除后，细胞集落显著减少。此外，U118MG和U251MG的EdU检测和U118MG细胞系均证实了这一点。
结果表明，XTP6在GBM细胞的体外增殖中起着关键作用。此外，我们的研究证实了XTP6的上调增强了GBM细胞的迁移和侵袭能力。
降低XTP6的表达显著阻碍了GBM细胞的迁移，沉默XTP6后U118MG和U251MG细胞的迁移和侵袭能力减弱。
总之，我们的研究结果表明，XTP6的上调可以了GBM细胞在体外的迁移和侵袭。
为了研究敲除XTP6是否会影响体内GBM的启动，我们利用免疫缺陷裸鼠作为体内模型。结果显示，sh-XTP6#1组和sh-XTP6#2组的裸鼠颅内肿瘤体积明显减少。
与来自sh-NC组的肿瘤样本相比，来自sh-XTP6#1组和sh-XTP6#2组的肿瘤样本中ki67阳性细胞的百分比明显降低。因此，降低XTP6的表达可以抑制体内GBM的启动。
我们在U118MG和U251MG细胞系中，利用生物素化的XTP6探针进行RNA下拉实验，结果表明，在对U118MG和U251MG细胞进行的RNA下拉实验中，共鉴定出242种蛋白。
从这些蛋白中选择了6个蛋白，其中NDH2最为普遍。通过qRT-PCR发现NDH2的mRNA表达水平最高。
此外，western印迹分析证实了U118MG和U251MG细胞中XTP6和NDH2之间的关联，这是由RNA下拉实验最初提出的。
为了确定NDH2和XTP6之间的直接相互作用，我们进行了RIP检测。结果显示，在U118MG和U251MG细胞中，XTP6和NDH2之间存在显著的相关性。
然而，NDH2表达水平的降低并没有改变XTP6的表达，同样，XTP6的调节，无论是过表达还是下调，对NDH2蛋白和mRNA的表达水平没有影响。
此外，FISH和免疫染色显示XTP6和NDH2在U118MG和U251MG细胞中共定位。以上结果表明，XTP6能够与NDH2直接相互作用，但两者之间似乎没有相互调控关系。
随后，我们进行了救援实验，以研究NDH2和XTP6之间的相关性是否促进了GBM的进展。过表达XTP6表达增强了U118MG和U251MG细胞的活力，而抑制NDH2则部分减轻了这些作用。
过表达XTP6后，细胞集落数量显著增加，而
NDH2敲低则部分抵消了这些结果。此外，EdU检测表明，XTP6表达的上调可以促进细胞增殖，而NDH2的沉默部分逆转了这些作用。
我们的研究结果表明，抑制NDH2的表达可以抵消GBM细胞中XTP6水平升高所诱导的增殖影响。
此外，伤口愈合试验显示，XTP6的上调显著增强了GBM细胞的运动性，而沉默NDH2的表达则部分否定了这些增强性。
transwell检测显示，XTP6表达上调后，GBM细胞的迁移和侵袭能力增加，而NDH2表达的减少则部分减弱了这些现象。
研究结果表明，抑制NDH2的表达可以部分抵消GBM细胞中过表达诱导的增强的迁移和侵袭特性。
我们推测NDH2可能通过作为RNA解旋酶来激活NF-κB信号通路。在U118MG、U251MG和原代细胞中，下调导致IκBα表达升高，而XTP6过表达导致IκBα表达降低。
而无论是通过过表达还是抑制，都没有改变U118MG、U251MG和原代细胞中IKK的磷酸化水平。
结果表明，XTP6通过调节IκBα的表达，而不是通过激活IKK，来发挥其对NF-κB信号通路的调控作用。
在本研究中，我们将被称为IκBα磷酸化抑制剂的BAY 11-7085引入过表达XTP6的GBM细胞和NC细胞，以评估IκBα的表达水平。
结果表明，在U118MG、U251MG和原代细胞中，IκBα表达水平低于接受匹配空载体的细胞，提示XTP6对IκBα表达的调控主要涉及转录控制。
此外，我们还研究了XTP6是否通过激活NF-κB信号通路来影响GBM的进展。XTP6表达的上调增强了NF-κB信号通路的激活，而NF-κB抑制剂JSH- 23的应用显著抑制了XTP6触发的激活现象。
使用JSH-23抑制NF-κB信号通路，部分逆转了XTP6过表达诱导的GBM细胞的恶性进展。
研究结果表明，XTP6可以通过降低IκBα转录本的表达水平来激活NF-κB信号通路，从而促进GBM的恶性进展。
为了阐明XTP6影响IκBα表达的分子过程，我们通过生物信息学分析预测了XTP6和IκBα启动子可能的结合位点。
通过荧光素酶报告基因分析表明，转染携带−1400~-1050bp片段的质粒后，荧光素酶活性明显降低。此外，通过ChIRP检测证实了XTP6与IκBα启动子区域之间的直接相互作用。
结果表明，XTP6与−1259和−1244bp之间的IκBα启动子区域结合，表明XTP6和IκBα启动子之间形成了三重构型。
我们的研究结果表明，XTP6通过形成IκBα启动子中序列的DNA-RNA三倍来减弱IκBα的转录。
为了确定XTP6对IκBα转录活性的影响，我们构建了一个包含IκBα启动子突变的pGL4载体。荧光素酶检测结果显示，IκBα启动子中表现出明显更高的荧光素酶活性。
我们检测了NDH2是否在介导IκBα启动子上的H3K27me3中发挥了作用。在NDH2沉默后的GBM细胞中，IκBα的表达上调。
此外，ChIP检测显示，H3K27me3和EZH2水平的升高在IκBα启动子内的XTP6结合位点特异性富集，这一过程是由与NDH2的相互作用促进的。
与基因沉默相关的标记物H3K9me3水平的升高，也在IκBα启动子内相同的XTP6结合位点富集，表明NDH2存在类似的调控机制。
此外，对NDH2表达的抑制可以逆转XTP6引起的IκBα表达的减少。综上所述，XTP6通过H3K27me3依赖的方式介导IκBα表达的下调。
转录因子c-myc是NF-κB信号通路的重要下游因子。免疫印迹分析显示，在应用NF-κB信号通路抑制剂后，c-myc的表达明显降低。
与人工过表达XTP6的细胞相比，阻断NF-κB信号通路显著降低了c-myc的表达。XTP6的沉默显著降低了c-myc的蛋白表达。
随后，我们使用以c-myc为靶点的敲除质粒来调节c-myc的表达水平，有效地降低了其表达。c-myc的沉默并不影响P50、P65、c-Rel和RELA的表达水平。
这些发现表明，c-myc是GBM细胞中NF-κB信号通路的关键下游因子。
我们还进一步分析了c-myc表达的改变对XTP6转录表达水平的影响。c-myc的抑制导致了XTP6表达的降低，而c-myc的上调增强了XTP6在GBM细胞中的表达。
此外，对XTP6启动子的生物信息学分析发现了两个潜在的c-myc结合位点，称为P1和P2。
为了验证c-myc与XTP6启动子上的预测位点之间的相关性，我们进行了ChIP分析，表明c-myc可以直接与XTP6启动子的P1位点相互作用。
此外，荧光素酶检测结果显示，c-myc驱动的荧光素酶表达通过P1位点突变显著降低，而P2位点突变没有明显的影响。
这意味着转录因子c-myc在GBM细胞中通过P1位点与XTP6启动子相互作用。
此外，我们的研究显示，降低c-myc的表达导致了GBM细胞恶性进展的抑制，可能是由于c-myc失活对驱动GBM的致癌通路的直接负面影响。
这些结果表明，lncRNA-XTP6通过与c-myc创建一个正反馈回路，促进NF-κB信号通路的激活，从而促进GBM的恶性进展。
我们通过构建体内模型，进一步研究抑制NF-κB信号通路是否可以阻止XTP6驱动的GBM进展。在皮下肿瘤模型中，XTP6的过表达促进了肿瘤的发展，而JSH-23则显著降低了XTP6诱导的致瘤作用。
JSH- 23治疗减缓了体重减轻，并延长了携带肿瘤的小鼠的生存时间。
与PBS处理的GBM组织相比，JSH-23显著降低了过表达XTP6的GBM组织中Ki-67的表达。这些结果证实了抑制nf-κB信号通路可以抵消体内XTP6介导的GBM的进展。
综上所述，研究结果提示c-myc/XTP6/ NDH2/NF-κB正反馈回路在促进GBM的恶性进展中至关重要。
了解XTP6在GBM中的关键功能及其参与激活NF-κB信号通路，有助于加深我们对驱动GBM进展的分子机制的理解。这一见解可以为为GBM患者创造创新的治疗药物铺平道路。
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