AGD1/USP10/METTL13 complexes enhance cancer stem cells proliferation and diminish the therapeutic effect of docetaxel via CD44 m6A modification in castration resistant prostate cancer
《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》（IF=11.3997）
摘要
背景：
大多数前列腺癌患者不可避免地发展为去势耐药前列腺癌（CRPC），此时多西紫杉醇等化疗药物成为一线治疗药物。
然而，化疗耐药性通常在治疗疗效的初始阶段后出现。越来越多的证据表明，癌症干细胞通过外泌体产生化疗耐药性。
本研究表明，来源于前列腺癌干细胞（PCSCs）的AGD1增强了前列腺癌细胞的干细胞性，降低了多西紫杉醇对CRPC的治疗效果。
方法：
采用实时荧光定量PCR（qPCR）检测AGD1和METTL13mrna的表达水平。采用蛋白印迹法和斑点印迹法检测蛋白表达水平。
通过细胞增殖试验、Transwell试验、EdU掺入试验、Annexin V-FITC/PI染色和球形形成试验，研究了AGD1和METTL13在CRPC中的潜在功能。
为了揭示AGD1的潜在机制，我们采用了RNA下拉实验、RIP、共免疫沉淀（co-IP）、质谱（MS）、甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）和单碱基延伸和基于连接的qPCR扩增方法（选择）。
采用异种移植小鼠模型和类器官模型，分析了AGD1和METTL13在多西紫杉醇治疗下对CRPC发生和转移的影响。此外，我们设计了脂麦芽壳聚糖纳米复合物给药系统，以探索AGD1在调节CRPC多西紫杉醇治疗耐药性中的作用。
结果：
AGD1在PCSCs和外泌体中表达上调。下调AGD1，通过抑制CRPC的茎干性，增强了CRPC对多西紫杉醇治疗的敏感性，反之亦然。
RNA pulldown结合MS、co-IP和RIP分析，表明AGD1与METTL13和USP10结合，形成一个复合物，通过USP10诱导的去泛素化促进METTL13蛋白的积累。
MeRIP检测和选择检测显示，METTL13通过m6A甲基化转录控制CD44mRNA的衰减。此外，这一过程还激活了pSTAT3/PI3K-AKT信号通路。类器官模型和脂质体-壳聚糖纳米复合物给药系统显示，降低AGD1的表达可增强多西紫杉醇对CRPC的治疗效果。
结论：
AGD1通过USP10/mettl13介导的CRPC中CD44 mRNA的衰减，通过增强肿瘤的生长和转移，介导PCSCs的干性和凋亡，促进多西紫杉醇治疗耐药性。
本研究采用了两种类型的CRPC细胞PC3和DU145。Western blot分析显示，与DU145细胞相比，DU145-PCSCs高表达干细胞标志物，如CD133、CD44、KLF4和SOX2。根据干细胞检测，ALDH在DU145-PCSCs中的表达高于DU145细胞。
从DU145-PCSCs中分离出并鉴定出其外泌体。CM-Dil示踪实验表明，标记的外泌体分布在DU145细胞的细胞质和细胞核周围。这些结果证实了从DU145-PCSCs中成功分离出的外泌体。
实时PCR分析显示AGD1在PC3/DU145-PCSCs及其衍生的外泌体中表达上调。AGD1在前列腺癌细胞中的表达水平高于人正常前列腺上皮细胞系RWPE-1细胞。
综上所述，AGD1在PC3/DU145-PCSCs及其外泌体中高表达，提示它可能参与了CRPC的进展。
采用重组pLenO-GTP-AGD1过表达质粒和shRNA质粒检测AGD1对CRPC多西紫杉醇化疗的影响。转染PC3和DU145细胞的AGD1质粒后，AGD1表达显著上调。
我们检测了多西紫杉醇在PC3和DU145中的一半最大抑制浓度。细胞增殖试验表明，与对照组相比，AGD1过表达PCSCs在第3天的PCa细胞增殖增加，而shAGD1PCSCs的外泌体培养后PCa细胞增殖减少。
Annexin V-FITC/PI检测显示，AGD1-OE-PCSCsexos作用下PCa细胞凋亡率降低。菌落形成实验表明，PCa细胞处理5 nM多西紫杉醇和补充AGD1-OEPCSCs-exos比PCSCs-exos形成更多的菌落。
EdU掺入试验结果显示，AGD1-OE-PCSCs-exos孵育的EdU阳性细胞百分比高于PCSCsexos。此外，AGD1-OE-PCSCsexos治疗后PCa细胞球直径显著增加。
综上所述，这些发现表明，从PCSCs中衍生的AGD1增强了PCa细胞的干细胞性，并抑制了多西紫杉醇的治疗作用。
利用shAGD1和AGD1过表达质粒检测内源性和外源性AGD1在多西紫杉醇对CRPC细胞治疗作用中的作用。
细胞增殖实验表明，在多西紫杉醇处理的CRPC细胞中，AGD1基因下调后细胞增殖减少，而过表达AGD1后细胞细胞增殖增加。Annexin V-FITC/PI检测显示，多西他赛处理的PCa细胞中AGD1敲低后细胞凋亡显著增加。
同样，在多西紫杉醇处理下，AGD1下调减少集落形成，过表达AGD1增强集落形成。EdU掺入实验显示，AGD1敲低降低了EdU阳性细胞的百分比。而在多西紫杉醇治疗下，AGD1过表达增加了EdU阳性细胞的百分比。
Western blot分析显示，AGD1下调后CD44和KLF4表达下调，过表达后CD44和KLF4表达上调。体内实验显示，多西紫杉醇治疗后，皮下异种移植瘤体积减少，shAGD1治疗后，AGD1过表达后，体积增加。
总的来说，内源性和外源性AGD1均增强了PCa细胞茎干性并在CRPC中导致多西紫杉醇耐药。
采用RNA下拉实验，探索AGD1在多西紫杉醇治疗耐药性中的分子机制。结果表明，AGD1可以下调PC3和DU145细胞中的USP10和METTL13蛋白。
此外，co-IP检测显示，USP10与METTL13形成复合物，以调节多西紫杉醇的治疗效果。USP10是一种去泛素化酶，在去除底物中的泛素方面起着至关重要的作用，从而促进底物蛋白的稳定性。用USP10质粒转染PC3和DU145细胞后，METTL13显著上调。
同样，MG132处理也增加了METTL13的表达。这些结果表明，USP10通过去泛素化促进METTL13的稳定。此外，co-IP检测显示，内源性AGD1调控METTL13泛素化水平，突出了AGD1在METTL13泛素化修饰中的关键作用。AGD1与METTL13的表达呈正相关。
总的来说，AGD1/USP10/ METTL13复合物通过METTL13去泛素化促进了CRPC的多西紫杉醇治疗耐药性。此外，双免疫荧光法显示，METTL13和USP10参与了CRPC细胞在细胞核内的生物学行为。
最后，USP10和METTL13之间的对接得分为−237.47，置信度得分为85%，表明存在稳定的交互作用。
为了研究METTL13在多西紫杉醇耐药中的作用，我们使用METTL13 shRNA或过表达质粒建立了稳定的PC3和DU145细胞系。
细胞增殖实验和EdU掺入实验表明，多西紫杉醇处理的CRPC细胞在过表达METTL13后增殖明显增加，而敲低METTL13后增殖下降，而AGD1逆转了这些作用。METTL13过表达后edu阳性细胞比例增加。
同样，平板克隆性分析表明，AGD1过表达显著增加了菌落集落形成率，AGD1敲低则降低。相反，METTL13过表达会降低细胞凋亡细胞水平。
METTL13过表达增强了CRPC细胞的干细胞性，而METTL13敲低降低了干细胞性。Western blot分析证实，在PC3和DU145细胞中，过表达METTL13后KLF4表达上调，而METTL13下调后CD44表达下调。
在体内，METTL13过表达后皮下肿瘤体积增加，shMETTL13治疗和腹腔注射多西紫杉醇后皮下肿瘤体积减少。
综上所述，这些发现表明，METTL13在体内和体外都降低了CRPC细胞对多西紫杉醇化疗的敏感性，而这些作用可被AGD1逆转。
metl13是m6A“作家”，与许多疾病有关。本研究探讨了AGD1或METTL13基因敲除或过表达后总m6A水平的变化。在PC3细胞中，AGD1或METTL13敲低后m6A水平显著降低，而AGD1或METTL13过表达后m6A水平升高。
这些结果表明，AGD1通过METTL13调控CRPC中m6A的修饰。此外，MeRIP检测被用于鉴定METTL13在CRPC中的潜在效应因子。在PC3细胞中发现了m6A共识基序AGACA。MeRIP检测结果显示，m6A峰分布在mrna的5’-UTR、编码序列（CDS）和3’-UTR处。
为了探讨mettl13依赖的m6A修饰的潜在机制，我们结合MeRIP-seq和mRNA-seq进行了综合分析,值得注意的是，在PC3细胞中，METTL13基因敲低后，CD44的3‘-UTR区域中m6A的积累显著减少。
对CD44的m6A位点进行选择检测。结果表明，下调METTL13后，45、64、71位点的n6-甲基腺苷修饰水平显著降低，说明这些位点在调控CD44甲基化修饰中发挥了重要作用。
此外，RIP检测显示，在PC3细胞中，与IgG组相比，抗mettl13与CD44 mRNA的相互作用水平较高。shMETTL13后CD44表达明显降低，过表达METTL13后CD44表达明显增加。
RNA衰减率分析显示，在PC3和DU145细胞中，下调METTL13后，CD44 mRNA的半衰期显著缩短。因此，METTL13甲基化CD44 mRNA，增强了其稳定性，而METTL13敲低则降低了CD44 mRNA的稳定性。
生物信息学分析显示，在PCa患者中，AGD1与CD44和METTL13的表达呈正相关，而METTL13与CD44的表达同样相关。
对PC3细胞中METTL13敲低后的差异表达基因（DEGs）进行KEGG分析，发现JAK-STAT和NFκB信号通路发生了显著变化，这对决定前列腺癌干细胞的命运至关重要。
采用肺转移模型研究AGD1敲低后对多西紫杉醇的化学敏感性。AGD1下调PC3和DU145细胞后，多西紫杉醇的治疗效果显著增强，导致转移灶明显减少。
此外，我们采用类器官模型进一步研究多西紫杉醇的治疗效果。细胞增殖试验显示，shagd1处理的类器官在细胞活力降低。AGD1基因敲除后，类器官的直径显著减少。
Western blot分析显示，AGD1敲低或过表达后，pSTAT3/ PI3K-AKT通路发生了显著改变，而NFκB和ERK1/2通路基本保持不变。
综上所述，这些结果表明，AGD1敲低通过pSTAT3/ PI3K-AKT信号通路增强了多西紫杉醇对CRPC的治疗作用。
我们合成了脂质体-壳聚糖/siAGD1纳米复合物（nanosiAGD1），作为一种很有前途的CRPC治疗方法，用于研究多西紫杉醇下调AGD1后的作用。
每周给予两次多西紫杉醇治疗后，来自PC3/DU145-nano-siAGD1细胞的皮下移植瘤体积显著减少。PC3- nano-siAGD1皮下移植瘤的免疫组化（IHC）显示，AGD1沉默后，METTL13和CD44的表达显著下调，而USP10的表达没有显著变化。
这些发现表明，AGD1是CRPC的一个很有前途的治疗靶点。
综上所述，本研究首次探讨了AGD1在CRPC中调节多西紫杉醇敏感性的作用。AGD1介导PCSCs的干细胞性和凋亡，并通过促进肿瘤的生长和转移促进多西紫杉醇治疗耐药性。
在机制上，AGD1与METTL13和USP10相互作用，介导在蛋白水平上的METTL13的泛素化和稳定性。因此，METTL13通过m6A的转录修饰增强了CD44 mRNA的稳定性。
此外，脂麦芽壳聚糖/siAGD1纳米复合物药物传递系统表明，AGD1敲低显著提高了在CRPC中多西紫杉醇的化疗疗效。
本研究通过AGD1/USP10/METTL13-CD44-pSTAT3/PI3K-AKT级联，研究多西紫杉醇化疗的分子机制提供了新的见解，为CRPC的基因治疗提供了新的靶点。
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