CircAKT3 promotes prostate cancer proliferation and metastasis by enhancing

the binding of RPS27A and RPL11

《Molecular Cancer》（IF=27.6999）

摘要

背景:

转移性前列腺癌（PCa）是前列腺癌患者死亡的主要原因。虽然环状rna（环状rna）被认为在肿瘤发生中起着关键作用，但它们在PCa背景下输注的特殊性尚未完全阐明。

方法：

采用RT-qPCR检测circAKT3在PCa细胞、肿瘤组织和邻近非癌组织中的表达。circAKT3的致癌作用是通过体外和体内实验的结合来确定的。

利用RNA下拉、RNA免疫沉淀（RIP）、荧光原位杂交（FISH）、免疫荧光（IF）和染色质免疫沉淀（ChIP）等方法，研究了circAKT3如何通过与RPS27A和RPL11的相互作用调节c-Myc活性。

此外，Western印迹法和进一步的体外和体内研究评估了circAKT3通过MST1对PCa进展的影响。

结果：

本研究鉴定了circAKT3在人类PCa细胞中的功能和调控，它来自于激酶-b3（AKT3）基因的外显子2到8。CircAKT3与疾病严重程度的临床指标显著相关，包括Dmico风险分类、Gleason评分和pT分期。

体外和体内实验均表明，下调circAKT3可抑制PCa细胞的增殖、迁移和侵袭。包覆si-circAKT3（LNP-si-circAKT3）的脂质纳米颗粒能有效地抑制PCa细胞形成的骨肿瘤的生长。

从机制上讲，circAKT3作为核糖体蛋白S27a（RPS27A）和核糖体蛋白L11（RPL11）之间的蛋白折叠，促进它们的细胞质易位，降低核RPL11水平，最终减少RPL11与c-Myc的相互作用，导致c-Myc驱动的巨噬细胞刺激1（MST1）表达的抑制增强。

因此，MST1的降低导致了PCa的进展和转移。CircAKT3的Alu元素和抖动（QKI）促进了RNA结合蛋白的形成。此外，RNA解旋酶URH49的下调导致circAKT3的核积累，从而抑制MST1的表达。

结论：

我们的研究表明，circAKT3作为一种蛋白折叠，促进RPS27A和RPL11之间的相互作用，从而注入c-Myc活性和PCa进展。

本研究强调了circAKT3在PCa中的关键作用及其作为阻止恶性肿瘤进展和转移的治疗靶点的潜力。

我们对PCa和ANP组织以及HM和WT PC-3细胞进行了高通量环状RNA测序。测序结果显示，与ANP和WT相比，circAKT3组织和HM PC-3细胞中circAKT3均显著上调，提示其在晚期PCa中的潜在作用。

数据库分析显示，circAKT3来源于AKT3基因的第2~第8个外显子。通过Sanger测序确定circAKT3的Te背剪接连接。凝胶电泳结果进一步验证了circAKT3的环状性质。

通过RT-qPCR和RNA-FISH检测确定亚细胞定位，表明circAKT3主要出现在细胞质中。此外，对BPH-1和多个PCa细胞系的RT-qPCR分析证实了circAKT3的上调，特别是在PCa和HM PC-3细胞中。

此外，我们分析了50例患者的ANP和PCa组织中circAKT3的表达，发现与非癌组织相比，癌组织明显升高。

我们的分析显示，circAKT3的高表达与D‘Amico风险分类、Gleason评分和pT分期呈正相关，提示circAKT3在PCa的进展中起着至关重要的作用。

我们在体外评估了circAKT3敲低对PCa细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。我们设计了两种针对circAKT3后剪接位点的特异性siRNA。通过CCK-8和集落形成实验评显示，下调circAKT3显著抑制了DU145、PC-3和22Rv1细胞的增殖。

下调circAKT3降低了CDK4蛋白的表达，同时增加了周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21和p27的表达。使用Transwell和伤口愈合试验表明，circAKT3显著降低了细胞的迁移和侵袭。

我们采用了异种移植瘤模型。来自circAKT3基因敲低的细胞的肿瘤明显小于来自对照组的细胞。结果表明，下调circAKT3可显著抑制肿瘤生长。

我们构建了一个实现circAKT3过表达的质粒，尽管circAKT3水平升高，但转染的细胞中AKT3的mRNA水平保持不变，这意味着过表达circAKT3的表达并不能影响AKT3 mRNA的表达。

体外实验表明，过表达circAKT3显著增强了PCa细胞的增殖、迁移和侵袭。同样，体内实验显示，过表达circAKT3的细胞产生的肿瘤明显大于对照载体组，表明下调和过表达circAKT3分别抑制和促进了PCa细胞的增殖、迁移和侵袭。

这些研究表明，circAKT3可能在PCa进展中起到致癌驱动因素的作用。

为了进一步研究circAKT3的生物学功能机制，我们采用了RNA下拉和LC-MS/MS分析，鉴定了RPS27A和RPL11的特定氨基酸序列，并结合了它们与circAKT3的相互作用。

对TCGA数据库的分析显示，PCa中RPS27A和RPL11均表达上调，提示其可能与癌症进展相关.我们进行了FISH和IF分析，清楚地显示了circAKT3与RPS27A和RPL11这些分子在细胞内的共定位。

进一步验证circAKT3、RPS27A和RPL11之间的相互作用，通过RNA下拉，然后进行蛋白印迹，提供了这些蛋白相互作用的直接证据。RIP检测证实了circAKT3与RPS27A和RPL11的特异性结合。

此外，Co-IP分析显示RPS27A和RPL11相互作用，表明形成了一个三元配合物。为了探究circAKT3在这种相互作用中的作用，我们用RNaseA处理该复合物，观察到RPS27A-RPL11相互作用减弱。

模拟图显示了circAKT3中RPS27A和RPL11的潜在结合区域，以及三元配合物的示意图。Westernblot显示，下调circAKT3后，PCa细胞中RPS27A和RPL11的核水平升高。

IF检测进一步证实了转染了circAKT3特异性sina或circAKT3过表达质粒的PCa细胞中RPS27A和RPL11的核和细胞质分布的变化，表明circAKT3调节RPS27A和RPL11的亚细胞定位，可能影响它们的细胞功能，并促进PCa的进展。

RPL11通过直接与核中的c-Myc结合来抑制c-Myc的致癌缺陷。为了研究这种相互作用，我们进行了Co-IP分析，结果表明circAKT3的下调增强了RPL11和c-Myc之间的相互作用。

此外，Co-IP实验融合了RPL11和c-Myc之间的相互作用，而RPS27A和c-Myc之间没有直接的相互作用。

这些结果表明，circAKT3通过注入RPL11-RPS27A复合物的形成，间接调节了RPL11-c-Myc的相互作用。

为了进一步研究circAKT3和PCa细胞中c-Myc调控的下游靶基因，我们在转染了si circAKT3或si c-Myc的细胞中进行了RNA-seq分析。

在多个PC1细胞系中，circAKT3调控的基因，包括DU145、PC-3和22Rv1。此外，研究发现，MST1在circAKT3基因下调后蛋白水平升高，而在circAKT3过表达后蛋白水平降低。

在MST1成功过表达后。采用CCK-8和集落形成实验，评价其对DU145、PC-3和22Rv1细胞增殖的影响。结果表明，过表达MST1可显著抑制PCa细胞的增殖。

此外，Transwell和伤口愈合试验表明，MST1过表达抑制了PCa细胞的迁移和侵袭能力。在使用异种移植瘤模型的体内研究中，MST1过表达组的肿瘤小于对照组（载体）组。

IHC染色图像以及肿瘤体积进展和肿瘤重量，说明过表达MST1显著抑制了肿瘤生长。在MST1基因敲除后，在体内外模型中，PCa细胞的体内外增殖均得到促进，细胞迁移和侵袭增强。

这些结果表明，MST1在PCa中起着肿瘤抑制因子的作用。我们的研究结果表明，circAKT3通过调节RPL11和c-Myc之间的相互作用来调节MST1的表达，从而促进PCa细胞的增殖、迁移和侵袭。

我们进一步探讨了c-Myc在PCa细胞中调节MST1表达的调控机制，重点鉴定了MST1启动子上潜在的c-Myc结合位点。我们采用ChIP-qPCR来评估c-Myc在预测位点之间的结合偏好。

结果表明，c-Myc可能优先结合到第三个启动子区域，称为B3。为了进一步验证B3结合位点的RT-qPCR产物的序列，我们采用Sanger测序，直接整合核苷酸序列，确保我们的fn编码的准确性。

这些结果为c-Myc通过MST1启动子上的特异性结合位点直接调控MST1提供了证据，强调了c-Myc等转录因子在基因表达调节中的关键作用。

我们研究了MST1上调对过表达circakt3的PCa细胞的影响，特别是其对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。集落形成和CCK-8检测表明，MST1逆转了circAKT3过表达对细胞增殖的影响。

Transwell试验、TEM试验和伤口愈合试验，结果表明，MST1的上调大大抵消了过表达circAKT3在PCa细胞中诱导的迁移和侵袭的增加。

体内研究证实了MST1上调对过表达circAKT3细胞增殖的影响，表明过表达MST1减轻了过表达circAKT3引起的增殖增强。

此外，我们还检测了MST1敲低在circakt3敲低的PCa细胞中被敲除的缺陷。下调MST1逆转了circAKT3下调对细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。

通过LNP传递siRNA、mRNA和DNA质粒可以使体内靶向治疗，在维持治疗性有效的同时显著降低了全身毒性。

我们建立了一个小鼠肿瘤异种移植模型，并给药LNP-si-ctrl或LNP-sicircAKT3，观察到LNP-si-circAKT3显著抑制肿瘤生长。circAKT3的敲除降低了22Rv1细胞中ENZA的半抑制浓度。

我们建立了一个骨转移模型，将PCa细胞注入胫骨，以模拟PCa细胞移植后骨中的肿瘤生长。在该模型中，使用LNP-si-circAKT3治疗可导致骨内肿瘤明显缓解。这些研究提出了一种新的方法，通过结合治疗转移性前列腺癌的传递系统。

为了研究这些扇形内含子在circAKT3生成中的作用，我们设计了4个不同的质粒。研究结果表明，只有质粒#1有效地促进了circAKT3的环化，这表明该质粒中的扇形内含子在环化过程中发挥了特殊的作用。

值得注意的是，质粒#5中这些序列的缺失导致了有效的循环化，这强调了它们的重要性。进一步的实验表明，AluSc和AluSx4序列（#6）的存在，而不是整个1000 bp的扇形内含子，可能会显著增强circAKT3的生物发生。

此外，这些序列被发现可以促进其他环状rna的循环化，如circSOBP和circUBE3A。此外，在细胞核中产生的环状RNA在URH49、输出蛋白-2和Ran-GTP 等蛋白的帮助下被输出出来。

我们研究了URH49在circAKT3核输出中的作用。URH49表达的减少导致circAKT3的核水平显著升高。

此外，URH49的下调还特异性地降低了DU145和PC-3细胞中MST1 RNA的水平.这些结果表明，circAKT3的环状化是由特定的Alu序列和rna结合蛋白QKI驱动的，而其核输出则受URH49的调控。

总之，该研究表明，circAKT3在PCa中表达上调，并作为一种致癌基因。LNP-si-circAKT3抑制由PCa细胞形成的骨肿瘤的生长。

在机制上，circAKT3通过结合RPS27A和RPL11作为蛋白支架。下调CircAKT3减弱了它们的相互作用，促进了RPL11的核易位，增强了RPL11介导的c-Myc抑制，导致它们的上调MST1,最终抑制PCa细胞的增殖、迁移和侵袭。

此外，Alu序列和rna结合蛋白QKI均促进了circAKT3的循环化，而URH49介导了circAKT3的核输出。

我们的研究结果为环状rna在PCa进展中的调控机制提供了新的见解，并可能成为PCa的潜在治疗靶点。

作者使用伯信生物明星产品RNA pulldown、RIP、Co-IP试剂盒进行了上述筛选与分子互作调控机制的研究。

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Bes5101(S)    RIP Kit       12T

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