Cuticle protein mediates the evolution of stress resistance by generating a decoy circular RNA in spider mite
《Science Advances》（IF=12.5001）
摘要
植食性螨虫，包括朱砂叶螨，是已知广泛侵染宿主植物和抗药性的节肢动物。我们发现，对fenpropathrin（氟啶脲）抗性的雌性螨虫（YN-FeR，具有靶标抗性：F1538I k突变）在各种压力条件下表现出显著增强的适应性，包括暴露于不同的杀螨剂以及高温（34°C）和低湿度环境（40%湿度）。
这种进化归因于抗性雌性螨虫的表皮增厚。表皮蛋白CPR25被确定为介导表皮增厚的基因。CPR25通过产生一个环状RNA（命名为circCPR25）来调节其自身的过表达，该环状RNA作为诱饵选择性地到miR-34~317簇。
这项研究揭示了蜘蛛螨在压力抗性进化中的独特机制。具体来说，蜘蛛螨中的表皮蛋白产生一个诱饵环状RNA来调节其自身的过表达，从而促进表皮增厚，并促进快速适应不良条件。
在残留涂层小瓶（RCV）生物测定中，YN-FeR品系对哒螨灵、联苯肼酯和丁氟螨酯分别表现出25.4倍、21.0倍和10.9倍的交互抗性。
然而，通过直接注射或口服给药处理成年雌螨时，YN-SS与YN-FeR品系间的死亡率无显著差异，表明当农药穿透YN-FeR品系成年雌螨体壁时存在非特异性渗透抗性。
与YN-SS和YN-KM品系相比，YN-FeR品系成年雌螨体壁超微结构显示其脊突、前表皮层及总表皮厚度分别显著增加了1.7倍、1.9倍和1.8倍。
对甲氰菊酯、哒螨灵、联苯肼酯和丁氟螨酯的渗透实验呈现一致性结果：相较于YN-SS品系，YN-FeR品系成年雌螨体表滞留了更多农药分子，显著减少了进入体内的农药量。
此外，在极端高温低湿条件下，YN-FeR品系成年雌螨的存活率与体重均显著高于YN-SS品系，这表明增厚的角质层显著减少了水分流失，并增强了抗性品系成年雌螨对此类环境条件的适应能力。
通过RNA-seq，在朱砂叶螨体内共鉴定出44种角质蛋白（CPs）。差异表达分析显示，与YN-SS品系相比，YN-FeR品系中有9种CPs呈现过表达，且均属于CPR家族。
定量聚合酶链反应（qPCR）验证了RNA-seq结果。CPR25表现出显著的18.6倍上调，暗示其在YN-FeR品系角质层增厚中的关键作用。与dsGFP处理组相比，YN-FeR品系中CPR25表达的敲低导致成年雌螨的脊状结构、前角质层及总角质层厚度分别显著降低1.4倍、2.1倍和1.7倍。
此外，该基因显著削弱了对杀螨剂渗透的阻碍作用，导致对哒螨灵、联苯肼酯和丁氟螨酯的敏感性大幅提升。
然而，敲除CPR25基因表达并未显著增强YN-FeR品系对甲氰菊酯的敏感性，这表明表皮增厚并非朱砂叶螨对甲氰菊酯产生抗性的主要因素。
在高温低湿条件下，与dsGFP处理组相比，CPR25基因敲除使YN-FeR品系成年雌螨的存活率和体重显著下降。这些发现共同表明：CPR25过表达通过介导YN-FeR品系的表皮增厚，从而增强其对不利环境条件的抗性。
miRNA在调控蛋白质编码基因表达中发挥着重要作用。为阐明CPR25显著上调的内在原因，我们比较了YNFeR与YN-SS品系的miRNA转录组，在朱砂叶螨体内发现了一个由miR-34和miR-317组成的miRNA簇。
YNFeR品系中观察到miR-34和miR-317表达的显著下调。在CPR25编码序列中识别出miR-34和miR-317的结合元件。双荧光素酶报告基因检测显示，人胚肾（HEK）293T细胞中CPR25报告基因载体的荧光活性受到显著抑制。
这种抑制作用随着相应结合元件的突变而消失，表明miR-34和miR-317结合至CPR25的预测区域，从而抑制其表达水平。进一步的体内实验证实了这些结果。
与阴性对照组相比，在YN-FeR品系中喂食miR-34和miR-317模拟物72小时后，CPR25表达水平分别显著降低了39.1%和60.0%。
此外，在喂食miR-34和miR-317模拟物后，YN-FeR品系雌性成螨的角质层超微结构、杀螨剂渗透性和生物测定结果均呈现出相似的变化模式。
具体表现为：角质层厚度显著减小；对哒螨灵、联苯肼酯和丁氟螨酯的角质层渗透障碍显著降低；对这三种杀螨剂的敏感性显著增强。
这些结果表明，miR-34~317基因簇通过反向调控CPR25表达参与角质层发育过程。
CPR25 DNA转录生成mRNA，同时其第二和第三外显子发生反向剪接，形成环状子代RNA，命名为circCPR25。研究人员设计了特异性反向引物，并成功从经核糖核酸酶R（RNase R）处理的cDNA模板中克隆出circCPR25产物。
在对应的基因组DNA（gDNA）模板中未观察到阳性条带。通过桑格测序鉴定了circCPR25的反向剪接位点，与RNA-seq结果一致。
此外，与水处理组相比，RNase R处理后circCPR25的表达水平未见显著变化，但线性CPR25和GAPDH转录本的表达水平显著下降。
这些结果有力支持了circCPR25的环状结构。qPCR检测显示，与YN-SS菌株相比，YN-FeR菌株中circCPR25的表达量出现16.0倍的显著上调。
此外，CPR25和circCPR25在0至7日龄雌性成螨发育过程中表现出高度一致的表达模式，其表达量在0至3天达到峰值后显著下降。
这些结果表明，在雌性成螨表皮发育过程中，CPR25与circCPR25的表达谱存在显著相关性，并突显0至3天是表皮发育的关键时期。
通过核质分离技术进行的亚细胞定位显示，CPR25主要定位于细胞质。在细胞质中，而circCPR25则同时分布于细胞核和细胞质中，且主要存在于细胞质内。
环状RNA circCPR25主要定位于朱砂叶螨细胞的细胞质中，因此我们进一步研究其是否抑制miR-34~317簇的功能。软件预测显示circCPR25序列中存在与miR-34~317簇结合的元件。
在YN-FeR雌性成螨中，利用生物素标记的circCPR25探针进行RNA下拉检测时，链霉亲和素磁珠能有效富集circCPR25。
与非靶向线性基因RP18s和miR-133-5p相比，circCPR25介导的富集作用显著提升了miR-34和miR-317的富集水平，这为circCPR25吸附并结合miR-34~317簇的功能提供了证据。
在YN-FeR雌性成螨中过表达生物素标记的miR-34和miR-317后，RNA下拉实验显示，与阴性对照组相比，链霉亲和素磁珠显著富集了miR-34和miR-317，同时circCPR25和CPR25也出现明显富集。
而作为非靶向对照基因的RP18s和α-Tub则未观察到富集现象，这表明在朱砂叶螨体内，circCPR25可能与CPR25竞争结合miR-34和miR-317。
双荧光素酶报告系统在体外验证了这些结果。当HEK293T细胞同时转染miR-34和miR-317模拟物并过表达circCPR25时，miR-34和miR-317对CPR25报告载体荧光活性的抑制作用消失，表明circCPR25竞争性结合了miR-34和miR-317。
在HEK293T细胞的细胞质中，miR-317的存在显著降低了其抑制CPR25表达的能力。此外，FISH技术显示，在YN-FeR雌性成螨的皮层细胞中，circCPR25与miR-34~317簇存在共定位信号，直接证明了它们之间的结合关系。
这些结果共同表明，CPR25通过释放circCPR25作为诱饵，使后者能够吸附并结合细胞质中的miR-34~317，从而确保其自身的过表达。
研究人员设计了一种靶向circCPR25反向剪接位点的小干扰RNA（siCirc）。与siGFP对照组相比，siCirc处理组的circCPR25表达水平显著降低了59.3%。CPR25表达也受到抑制，降幅达78.3%。
同时，miR-34和miR-317的表达水平显著上调。此外，在YN-FeR品系雌螨中，表皮脊突、前表皮层及总表皮厚度分别减少了1.5倍、2.7倍和1.9倍，其对哒螨灵、联苯肼酯和丁氟螨酯的穿透抗性效应也显著减弱。
生物测定实验表明，沉默circCPR25基因表达能显著提高YN-FeR品系雌性成螨对哒螨灵、联苯肼酯和丁氟螨酯的敏感性，导致各浓度梯度下的死亡率增幅达20.6%至39.2%。与siGFP处理组相比，circCPR25表达敲除显著降低了存活率。
在高温低湿条件下，YN-FeR品系成年雌螨的体重发生变化。因此，circCPR25在YN-FeR品系中的过表达显著下调了miR-34~317基因簇，进而调控CPR25过表达和表皮增厚，从而介导对不利环境的抗性。
沉默YN-SS品系中circCPR25的表达导致雌螨表皮厚度显著减少，表明circCPR25在朱砂叶螨表皮发育中起重要作用。
总体而言，我们以植食性螨类为模型，揭示了拟除虫菊酯抗性进化与表皮发育变异之间的遗传关联。
更重要的是，我们发现节肢动物中存在一种独特的分子调控机制——表皮蛋白通过产生诱饵环状RNA来调控自身过表达。这一发现可能有助于阐明节肢动物进化出逆境适应能力的分子基础。
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