N6-methyladnosine of vRNA facilitates influenza A virus replication by promoting the interaction of vRNA with polymerase proteins

《PNAS》（IF=9.1005）

摘要

甲型流感病毒（IAV）的正链和负链RNA中均存在N6-甲基腺苷（m6 A）修饰，这种修饰会影响病毒的复制能力和致病性。然而，关于m6 A在IAV RNA中的调控机制仍知之甚少。

本研究通过分析不同亚型IAV病毒RNA的m6 A甲基化情况，发现该修饰能显著提升RNA聚合酶活性并促进病毒复制。通过在IAV多种病毒RNA（vRNA）上敲除m6 A甲基化基序，我们证实vRNA中m6 A缺失会抑制病毒基因表达及体外复制能力。

此外，vRNA中的m6 A缺失还会降低IAV在小鼠模型中的致病性。从机制层面分析，vRNA中m6 A的缺失通过依赖m6 A甲基转移酶的方式，破坏vRNA与vRNP蛋白的相互作用，从而阻碍病毒核糖核蛋白复合体（vRNP）的组装——但不影响m6 A识别蛋白的功能。

综合研究结果表明，m6A修饰在病毒RNA中发挥着关键作用：既能促进RNA聚合酶复合体的活性，又能调控病毒复制和致病性，这一发现为开发新型抗流感策略提供了重要理论依据。

先前研究显示，两种适应小鼠的实验室H1N1病毒株PR8和WSN的病毒RNA中均含有内部m6 A修饰。

H1N1、H3N2、H7N9和H9N2病毒的病毒转录本中均存在m6 A修饰，同时在感染H5N6病毒的MDCK、RAW264.7、VERO和HD11细胞（分别来源于犬类、啮齿类、灵长类和禽类）的病毒RNA中也检测到该修饰。

这些数据表明，甲型流感病毒各亚型的vRNA、cRNA和mRNA中均存在m6 A残基，且vRNA的m6 A修饰在不同亚型和物种间具有保守性。

为探究m6 A修饰对甲型流感病毒（IAV）复制的影响，我们采用siRNA技术敲低甲基转移酶METTL3和METTL14的表达。敲低这两种酶会显著抑制SC15病毒的复制，而过表达则能显著促进病毒增殖。

此外，METTL3和METTL14还能促进H1N1、H7N9及H9N2病毒在A549细胞中的复制。值得注意的是，敲低METTL3和METTL14会大幅降低病毒RNA的m6 A修饰水平，而过表达METTL3则能逆转这种修饰的减少趋势。

过表达METTL3和METTL14还能促进感染细胞中IAV的vRNA、cRNA及mRNA表达。

由于病毒RNA的表达水平与RdRP活性直接相关，我们进一步探究了甲基腺苷酸化修饰对甲型流感病毒RdRP活性的影响。

首先，我们验证了萤火虫荧光素酶基因的负链和正链转录本均含有m6 A修饰。实验发现，敲低METTL3和METTL14基因会降低病毒RdRP活性，而过表达这两种基因则能以剂量依赖的方式增强RdRP活性。

我们还构建了pPol I-NA-vRNA质粒，用于在人类RNA聚合酶I启动子调控下表达NA vRNA。

通过转染PB2、PB1、PA和NP表达质粒及pPol I-NA-vRNA的细胞实验发现，METTL3和METTL14的过表达不仅显著提升了vRNA的表达水平，还增强了由vRNA转录产生的cRNA和mRNA的复制效率。

这些数据表明，m6A甲基转移酶在流感病毒RNA合成及其复制过程中发挥着关键作用。

为绘制SC15病毒基因组与转录组中的m6 A修饰位点，对样本进行m6 A免疫沉淀实验，并采用高通量测序技术（meRIP-seq）进行分析。

结果显示m6 A峰遍布整个病毒基因组和转录组。这些结果验证了我们识别病毒基因组中m6 A位点的方法。

通过整合meRIPseq数据并运用生物信息学分析工具，我们在SC15基因片段的正负链上鉴定出高可靠性m6 A位点：NP基因负链6个位点、NA基因负链4个位点、PB1基因负链2个位点。

为直接验证m6 A在甲型H1N1流感病毒复制中的作用，我们在不改变编码氨基酸的前提下对m6 A位点进行突变，并构建了NP、NA或PB1病毒RNA中缺失m6 A位点的重组突变病毒。

通过miRIP-qPCR检测发现，突变病毒中NP vRNA的m6 A水平显著降低，而PA/PB1 vRNA及NP mRNA的m6 A水平则未受影响。

为进一步探究病毒RNA与m6 A相关蛋白在感染细胞中的相互作用，我们采用生物素标记的NP/NA病毒RNA特异性探针进行免疫共沉淀实验。

结果显示，在rSC15-NPv-mut和rSC15-NAv-mut突变株中，NP或NA病毒RNA与m6 A相关蛋白的相互作用受到显著抑制。

这表明突变株中的病毒RNA确实存在m6 A甲基化缺陷。

我们首先检测了突变病毒中m6 A缺失对病毒复制的影响。病毒生长动力学分析显示，rSC15-NPv-mut病毒的蛋白表达量和复制能力均显著降低。

在A549细胞中，m6 A缺失持续抑制了rSC15-NAv-mut和rSC15-PB1v-mut病毒的复制能力。综合实验结果表明，vRNA中的m6A缺失会显著降低甲型流感病毒的体外复制效率。

为探究m6 A甲基化修饰在病毒RNA中对甲型流感病毒毒力的影响，我们通过小鼠模型评估了野生型（WT）和突变型病毒的复制能力与致病性。

结果显示，野生型病毒引发严重疾病，其半数致死剂量（MLD50）为103.17 EID50，导致小鼠死亡。

而突变型病毒的致死率则显著降低，MLD50值分别降至104.38、104.5和104.68 EID50。接种rSC15病毒的小鼠肺部、鼻甲及脑组织中的病毒滴度，明显高于接种突变型病毒的对照组小鼠。

与这些发现一致的是，病理学检查结果表明，rSC15病毒感染对肺部造成了严重损伤，具体表现为肺泡出现大量细支气管化、广泛的免疫细胞浸润以及强烈的炎症反应。

相比之下，突变病毒在感染后第3天和第5天引发的组织损伤则相对轻微。

这些结果共同表明，vRNA中m6 A的缺乏显著降低了IAV在小鼠中的复制和致病性。

接下来我们研究了病毒RNA的m6 A修饰如何影响甲型流感病毒（IAV）的复制和致病性。本研究发现，在感染野生型或突变型病毒的细胞中，或转染表达野生型与m6 A缺陷型NP病毒RNA的质粒时，m6 A缺失会促进病毒RNA与RNA传感器RIG-I的相互作用。

这些结果表明，即使基因组八个片段中的某个片段缺失m6 A修饰，也不会影响IAV引发的I型干扰素应答。

鉴于病毒RNA的复制与转录是甲型流感病毒生命周期中的关键过程且由vRNP复合体介导，我们进一步探究了m6 A修饰对病毒RNA复制与转录的影响。

在病毒感染的细胞中，rSC15-NPv-mut或rSC15-NAv-mut病毒的vRNA、cRNA及mRNA表达水平均显著低于野生型病毒。

通过生物素标记的NP vRNA特异性探针进行免疫共沉淀实验发现，NP vRNA与m6 A相关蛋白的相互作用在m6 A缺陷状态下受到抑制。

在转染了表达PR8病毒PB2、PB1、PA和NP蛋白的质粒的细胞中，vRNA的表达水平未见差异，但源自vRNA的cRNA和mRNA表达量在pPol I-NP-vRNA-mut或pPol I-NA-vRNA-mut质粒中显著下调。

研究人员构建了pPol I-NP/NA-cRNA-WT和pPol I-NP/NA-cRNA-mut质粒，分别用于表达源自rSC15、rSC15-NPv-mut病毒或rSC15-NAv-mut病毒的cRNA。

由于突变仅破坏了病毒基因组负链上的m6 A修饰基序，野生型和突变型病毒表达的cRNA均保留相同的m6 A修饰。如预期所示，源自cRNA的vRNA表达量未见显著差异。

这些结果表明，vRNA的m6 A缺失会抑制cRNA向mRNA的合成，进而阻碍由cRNA生成的子代vRNA表达。

为阐明m6 A修饰在病毒RNA复制与转录中的调控机制，我们首先分析了vRNA与vRNP蛋白的相互作用。

CLIP实验结果显示，m6 A缺陷会削弱NP蛋白携带的vRNA与质粒表达的vRNP蛋白之间的相互作用。

在转染PR8病毒株PB2、PB1、PA和NP蛋白表达质粒的细胞中，m6 A缺陷型vRNA捕获的vRNP蛋白数量明显少于野生型vRNA。

我们进一步评估了病毒感染细胞中vRNA与vRNP蛋白的相互作用。

由于突变病毒的复制效率及其在突变病毒感染细胞中的RNA表达水平均低于野生型病毒，我们对不同剂量的病毒进行了细胞感染实验。

结果显示：在rSC15或突变病毒感染的细胞中，突变型vRNA与vRNP蛋白的相互作用显著减弱，而野生型vRNA与vRNP蛋白的相互作用则未见明显差异。

突变型vRNA捕获的vRNP蛋白数量少于野生型vRNA，但与突变病毒中非突变型vRNA片段的相互作用无显著差异。

为进一步研究，我们合成了46核苷酸生物素标记的vRNA迷你手柄，并分别添加或不添加m6 A修饰。

实验发现，经m6 A修饰的vRNA捕获更多病毒蛋白及m6 A相关蛋白。这表明m6A修饰能显著增强vRNA与vRNP蛋白的相互作用。

我们开始研究m6 A相关蛋白在m6 A修饰的vRNA与病毒核糖核蛋白复合物（vRNP）相互作用中的作用。

病毒生长动力学分析表明，m6 A缺失会降低rSC15在A549细胞中的复制效率。然而，在METTL3缺陷细胞中，rSC15与rSC15-NPv突变病毒的复制效率并无显著差异。

此外，m6 A缺失会降低感染细胞中vRNA、cRNA和mRNA的表达水平，而METTL3基因敲低可缓解这种下降趋势。这些结果表明，m6 A缺失通过依赖甲基转移酶的作用机制，显著抑制了病毒RNA的表达和病毒复制。

此外，异位表达的METTL3和METTL14显著增强了病毒感染细胞中NP与vRNA的相互作用。

在A549细胞中，突变型NP vRNA与PB1/NP蛋白的相互作用减少，而METTL3缺失则缩小了野生型与突变型vRNA与PB1/NP的差异。

在感染野生型或突变型病毒的细胞中，敲低METTL3/14并过表达ALKBH5/FTO可显著缩小野生型与突变型vRNA与病毒蛋白的相互作用差异。

经m6 A修饰的RNA通常被识别蛋白识别，从而赋予下游功能。因此，我们研究了识别蛋白在病毒RNA与病毒核糖核蛋白复合体（vRNP）相互作用中的作用。

病毒生长动力学分析表明，过表达YTHDF2和YTHDF3显著促进了病毒复制。然而，在敲低NC、YTHDF1/2/3或YTHDFC1的细胞中，病毒RNA与NP蛋白的相互作用未见差异。

敲低YTHDF2并未影响PB2/PB1/PA蛋白与pPol I-NP-vRNA-WT或pPol I-NP-vRNA-mut质粒衍生vRNA的相互作用。

这些数据表明，vRNA的m6A修饰促进了vRNA和vRNP蛋白以一种不依赖阅读蛋白的方式相互作用。

综上所述，我们证实病毒RNA的m6 A修饰在不同亚型的甲型流感病毒中普遍存在。研究发现，vRNA中m6 A的缺失会破坏其与病毒核糖核蛋白复合体（vRNP）的相互作用，从而抑制病毒复制并降低致病性。

这些发现揭示了m6A在调控甲型流感病毒复制和致病性中的关键作用。针对甲型流感病毒的转录后修饰进行靶向干预，可能为开发新型抗病毒治疗策略提供新思路。

未来研究将重点探讨m6 A位点在病毒正链RNA中的作用，包括其对病毒复制、先天免疫应答及病毒致病性的影响。

作者使用伯信生物明星产品RAP进行分子调控机制研究。

伯信好物推荐

RAP Kit

产品介绍：

RNA 反义纯化技术（RNA Antisense Purification，RAP）用于研究RNA与RNA、RNA与蛋白质之间的相互作用。根据研究对象不同，RAP技术结合了高通量测序（RAP-Seq）和质谱技术（RAP-MS），分别研究与目标RNA互作的RNA和蛋白质。

伯信 RAP Kit分为：

Bes5103-1(S)      RAP-RNA kit         12T       

Bes5103-1(N)      RAP-RNA kit         30T  

Bes5103-2(S)     RAP-Protein kit      12T

Bes5103-2(N)     RAP-Protein kit      30T

Bes5103-3(S)     RAP-RNA、protein kit      12T

Bes5103-3(N)     RAP-RNA、protein kit    30T

实验原理：

RAP技术通过设计生物素探针组拉取目标RNA，使与其共同作用的RNA或蛋白质（RBPs）富集在磁珠上并被洗脱。最后，通过高通量测序得到该调控RNA转录调控的下游靶基因，同时，也可以通过Western Blot验证RBPs，或通过MS鉴定未知蛋白。

技术流程：

结果实例：

产品优势：

1. 伯信独立研发，具有自主知识产权。

2. 灵敏度高，稳定性好。

3. 检测方法领先，结果准确、重复性好。