邻位连接技术（Proximity Ligation Assay, PLA） 的核心逻辑是 “双抗体识别→邻近探针连接→信号扩增→原位检测”，仅当两个目标分子（蛋白或修饰位点）距离足够近（通常 < 40 nm，即分子间可发生直接互作的距离）时，才能启动信号输出，具体步骤如下：

① 特异性识别（双抗体结合）：用两种不同种属来源的一抗分别识别目标互作蛋白（如蛋白 A 和蛋白 B）：一抗 1 靶向蛋白 A，一抗 2 靶向蛋白 B，且二者需来自不同物种（如兔源抗 A、鼠源抗 B），避免交叉反应。

②探针偶联（二级抗体 - 寡核苷酸结合）：加入 “种属特异性二级抗体 - 寡核苷酸探针” 复合物：抗兔二抗偶联探针 1（含一段单链 DNA），抗鼠二抗偶联探针 2（含另一段互补单链 DNA）。此时，若蛋白 A 与 B 发生互作（距离 < 40 nm），则探针 1 与探针 2 会因抗体的结合而彼此邻近。

③邻近连接（DNA 连接酶催化）：加入连接酶：仅当探针 1 与探针 2 距离足够近（<40 nm）时，二者的互补 DNA 序列可通过碱基配对形成局部双链，被连接酶连接成一个完整的 DNA 环。若蛋白 A 与 B 不互作（距离过远），探针无法靠近，连接反应不发生。

④信号扩增与检测：加入引物和 DNA 聚合酶，以连接形成的 DNA 环为模板进行滚环扩增（Rolling Circle Amplification, RCA）：扩增产物（长单链 DNA）可与荧光标记的探针杂交，形成一个明亮的荧光点（每个互作事件对应一个荧光点）。

⑤通过荧光显微镜观察：荧光点的位置反映互作发生的细胞内定位，荧光点的数量可定量互作强度。

技术流程

技术优势

1、抓得住“瞬间”：传统方法追不上的瞬时互作，比如VEGF调控的蛋白复合物动态变化，它能精准捕捉时间轨迹。

客户提供

①　组织：新鲜或固定（10%中性甲醛、4%多聚甲醛）组织样本；

②　细胞：新鲜（大于106）或固定（10%中性甲醛、4%多聚甲醛）细胞样本；

③　切片：石蜡切片，冰冻切片以及细胞爬片，涂片；

④　实验信息：基因名称及ID；

⑤ 实验材料：两个蛋白抗体一抗(分别为鼠抗、兔抗)；

①　染色后的切片；

②　电子图片（共聚焦拍照）；

③　实验报告（实验仪器、试剂、方法、结果、结论）。