双分子荧光互补(Bimolecular Fluorescence Complementation，BiFC)是将荧光报告蛋白按照规则分成没有荧光的两段，分别与诱饵蛋白和捕获蛋白融合，只有在诱饵蛋白和捕获蛋白发生相互作用的情况下，两段不完整的荧光报告蛋白才会形成完整的报告蛋白，发出荧光。

其后发展出的多色荧光互补技术(multicolor BiFC)，能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较。因此，不论是亲和力较弱的结合还是暂时性的结合都不会被遗漏。

　　BiFC技术的最大缺陷是多个BiFC系统对温度敏感。温度高时，片段间不易互补形成完整的荧光蛋白。一般在30℃以下形成互补效应好，温度越低，越有利于片段之间的互补，这就对研究细胞在生理条件下的蛋白质相互作用带来不利因素。目前，只有基于venus、citrine和cerulean的3个双分子荧光互补系统可以在生理温度条件下实现片段互补。此外，BiFC系统需要2个荧光蛋白片段互补，重新形成完整的活性蛋白以及发生荧光蛋白自体催化过程，不同的BiFC系统往往需要几分钟到几小时完成该过程，因此观察到的双分子荧光信号滞后于蛋白质的相互作用过程，不能实时地观察蛋白的相互作用或蛋白复合物的形成过程。

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