Iron overload reprogramming lipid metabolism through the IRP1–SCAP axis in fibroblast-like synoviocytes aggravates bone destruction in rheumatoid arthritis

《Experimental & Molecular Medicine》（IF=12.9）

摘要

类风湿关节炎（RA）是全球范围内导致残疾的主要原因之一。尽管在RA患者关节病变中已观察到铁沉积现象，但其对残疾程度的具体影响尚不明确。

本研究采用全面的多组学分析方法，阐明铁过载在RA中的作用机制及潜在病理基础：首先，RA患者队列的临床影像学检查显示，滑液中亚铁离子水平升高与关节损伤程度呈正相关；

在K/BxN血清转移诱导的关节炎小鼠模型中，铁螯合剂 DFO 治疗可显著减轻骨质破坏；在细胞功能层面，通过人源化滑膜炎模型证实过量铁会诱导成纤维样滑膜细胞（FLSs）发生侵袭性迁移和侵袭；

从机制层面来看，转录组学与代谢组学的多组学整合分析表明，FLSs在应对铁暴露时存在脂质合成通路的富集表达。

脂质转录因子SREBP1在类风湿关节炎脂肪源性巨噬细胞（RA-FLSs）中表达尤为显著，其基因敲除或药物抑制均能显著减轻铁过载在体外和体内引起的病理效应。

在分子层面，铁调节蛋白IRP1在铁刺激下会从SREBP1适配蛋白 SCAP 的mRNA 5′非翻译区解离，从而促进该蛋白的翻译；这一过程可促使SREBP1被切割并激活，进而上调参与脂肪酸及胆固醇生物合成的相关基因表达。

我们的研究结果阐明了IRP1- SCAP 轴是侵袭性脂肪源性巨噬细胞中脂质代谢重编程的关键调控机制，并凸显了其通过调节“铁-脂质”相互作用作为类风湿关节炎治疗靶点的潜力。

一、研究背景

1.RA病理特征：滑膜过度增生、血管翳形成，FLSs呈现类肿瘤表型（增殖、迁移侵袭、抵抗凋亡），驱动软骨与骨侵蚀；FLSs高度依赖糖脂、胆固醇等代谢供能，代谢紊乱是RA关键发病环节。

2. 关节铁稳态异常：RA病灶存在铁蓄积，但铁过载如何调控FLSs功能、参与骨破坏尚不清晰；团队前期证实铁过载可诱导巨噬细胞铁死亡、扰乱关节免疫，但未阐明对FLSs的特异性作用。

3. 科学空白：铁代谢与脂质合成两大通路的直接分子交叉机制未知；缺乏关节局部铁蓄积调控FLSs脂代谢、加重关节损伤的完整上下游通路。

二、研究策略与技术路线、

1.研究核心：明确关节铁过载通过IRP1-SCAP-SREBP1信号轴重编程成纤维样滑膜细胞（FLSs）脂质代谢，加剧类风湿关节炎（RA）滑膜增生与骨破坏，揭示铁-脂质交叉调控新机制，为RA提供靶向治疗靶点。

2. 核心技术：临床队列样本检测、K/BxN血清诱导关节炎（STIA）小鼠、人源化滑膜炎SCID小鼠模型；转录组/代谢组多组学；RNA pulldown、FISH-IF、EMSA、RIP、分子对接等RNA-蛋白互作验证技术；基因敲低/药物干预。

三、结果

3.1 临床队列与动物模型证实关节铁蓄积直接加重RA滑膜增生与骨破坏

3.1.1 临床滑液铁定量与MRI影像学关联分析对RA、痛风GA、骨关节炎OA三组患者滑液铁离子检测结果显示：RA组滑液总铁、亚铁（Fe²⁺）水平显著高于另外两组，RA滑液中铁离子绝大多数以亚铁形式存在。

公共滑膜转录组数据集GSE89408富集分析提示，相较于健康创伤对照，RA滑膜中铁离子稳态、铁应答相关通路显著激活，铁代谢蛋白表达紊乱：铁摄取受体TFRC下调，铁外排蛋白FPN、铁储存蛋白FTL、FTH1显著升高，直接证明RA滑膜局部存在铁过载微环境。

3.1.2 铁螯合剂DFO干预STIA小鼠体内验证铁的致病作用采用K/BxN血清诱导STIA急性关节炎模型，设置DFO预防给药组（造模同期给药）与治疗给药组（发病后干预）。

1. 表型评分：DFO处理显著降低小鼠关节炎发病率、四肢肿胀评分；

2.  病理染色：H&E证实滑膜浸润、滑膜增生减轻；TRAP染色显示破骨细胞数量下降；甲苯胺蓝染色提示软骨基质丢失显著缓解；

   
   

3. 全身与局部炎症分层分析：ELISA检测外周血促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6无明显改变，但爪部组织蛋白芯片结果显示CCL2、CXCL1、CXCL12趋化因子、血管生成因子ANG、基质降解酶MMP3/8/9、ADAMTS1均大幅下调。

   
   

该结果关键提示：铁过载并非通过系统性全身炎症加重RA，而是特异性调控关节局部趋化、基质降解通路，促进滑膜侵袭与骨破坏，这也解释了为何铁螯合剂仅改善关节结构性损伤，不影响外周循环炎症因子。

3.2 亚铁直接诱导RA-FLS获得高增殖、高侵袭恶性表型，并驱动细胞脂质大量蓄积

3.2.1 RA滑液中铁是诱导FLSs活化的核心介质体外采用10% RA患者滑液刺激FLSs，CCK-8、Transwell实验证实滑液可显著提升细胞活力、迁移与侵袭能力；向体系中加入铁螯合剂DFO后，滑液的促活化效应完全消失，证明滑液内过量铁是激活FLSs的核心活性物质。

3.2.2 亚铁单独刺激复刻FLSs侵袭表型

1.  存活与增殖：亚铁不诱导FLSs死亡，反而提升细胞抗脂质过氧化能力；流式细胞周期检测显示S+G2/M增殖期细胞比例显著上升，CCK-8证实细胞活力随铁处理时间梯度升高；

   
   

2. 侵袭相关分子qPCR：铁处理后基质金属蛋白酶MMP3/9/10/13、趋化因子CCL3、CXCL5、促炎因子IL-6、TNF-α表达显著上调，为细胞穿透软骨基质、招募炎症细胞提供分子基础；

   
   

3. Transwell迁移/侵袭实验：铁处理组穿透膜细胞数量远高于对照组，明确亚铁直接增强FLSs运动与基质降解能力。

   
   

3.2.3 人源化滑膜炎SCID小鼠体内验证铁介导软骨侵蚀构建软骨-明胶海绵皮下移植SCID小鼠模型，分别植入PBS处理、亚铁预处理的RA-FLSs。

造模60天后病理切片显示：亚铁刺激的FLSs大量浸润原发植入软骨，造成大面积软骨基质缺损；对侧无FLSs直接接触的对照软骨同样出现明显破坏，说明铁活化的FLSs可通过分泌基质酶、趋化因子远距离损伤软骨，在体内完整复刻RA骨侵蚀病理特征。

3.2.4 多组学证实铁过载全面激活FLSs脂质从头合成通路

1.  转录组RNA-seq：铁处理FLSs共获得293个上调基因、315个下调基因；上调基因GO、Reactome富集集中于脂肪酸、胆固醇生物合成通路，脂合成关键酶FASN、ACLY、HMGCR、CYP51A1、SCD1、FDPS全部显著上调。

2. 非靶向代谢组LC-MS：铁处理后细胞内游离脂肪酸FFA、甘油三酯TG、总胆固醇含量显著升高；101个差异代谢物中脂质类占比最高（脂酰类38.10%、甘油磷脂38.09%、类固醇16.67%），前列腺素J2、LysoPE等促炎活性脂质显著富集。

   
   

3. 脂质荧光染色与功能回补：Bodipy、Filipin III染色直观显示铁诱导细胞内脂滴、胆固醇堆积，DFO可逆转该现象；分别给予脂肪酸合成抑制剂C75、甘油磷脂抑制剂FSG67，可完全阻断铁诱导的FLSs迁移侵袭，证明脂质蓄积是铁驱动FLSs恶性表型的必需中间环节，并非伴随性改变。

3.2.5 临床滑膜脂质水平与滑液铁浓度存在相关性免疫组化显示RA患者滑膜脂合成关键酶FASN、HMGCR表达显著高于健康对照；相关性分析提示滑液亚铁浓度与FFA、TG、胆固醇水平呈正相关，从人体样本层面印证铁过载与滑膜脂质蓄积的联动关系。

3.3 SREBP1是铁介导FLSs脂质代谢重编程、细胞侵袭的核心转录开关

3.3.1 铁特异性调控SREBP1蛋白活化，不改变转录水平

qPCR结果显示，亚铁处理后FLSs内SREBF、SREBF2 mRNA总量无显著变化；Western blot时序检测可见：铁刺激后SREBP1前体蛋白pSREBP1逐步减少，成熟活化型mSREBP1随处理时间梯度升高，而SREBP2蛋白剪切、活化无任何改变。

免疫荧光IF证实铁诱导SREBP1由细胞质向细胞核转位，入核后发挥转录功能；RA滑液诱导的SREBP1活化可被DFO完全逆转，证实铁是SREBP1激活的必要条件。

单细胞转录组分析显示：SREBF1特异性高表达于FLSs，在滑膜巨噬细胞、T/B细胞、内皮细胞中低表达；SREBF2在各类滑膜细胞广谱低表达，解释了铁仅靶向调控FLSs内SREBP1的细胞特异性机制。

3.3.2 药物抑制SREBP1可逆转铁诱导的体外、体内病理表型

1.  体外细胞实验：广谱SREBP抑制剂Fatostatin 1、SREBP1特异性抑制剂EPA联合亚铁处理FLSs，细胞增殖、迁移、侵袭能力显著回落，脂合成酶表达与细胞内脂质蓄积同步下降；

   
   

2. STIA动物体内干预：腹腔注射Fatostatin 1可降低小鼠关节炎评分，减轻滑膜增生、软骨与骨破坏，病理损伤程度与DFO干预组接近。

3.3.3 基因敲低SREBP1从根源阻断铁的致病效应

构建SREBP1-shRNA慢病毒稳定敲低FLSs，Western blot验证敲低效率；铁刺激后，阴性对照组细胞侵袭能力大幅上升，SREBP1敲低组无明显变化。

人源化SCID小鼠模型进一步证实：SREBP1沉默的FLSs经亚铁处理后，无法造成明显软骨侵蚀，直接证明SREBP1是铁调控FLSs侵袭与脂代谢的不可缺少的下游分子。

3.4 IRP1通过转录后调控SCAP翻译，介导铁信号上游传递，IRP1-SCAP为线性上下游通路

3.4.1 铁上调SCAP蛋白表达属于翻译水平调控，与蛋白降解无关Western blot时序检测发现，亚铁处理3 h即可上调SCAP蛋白，且随时间持续升高；但qPCR显示SCAP mRNA表达无变化，说明调控发生在转录后翻译阶段。

分别使用蛋白合成抑制剂CHX、蛋白酶体抑制剂MG132、自噬溶酶体抑制剂CQ处理FLSs：CHX完全消除铁诱导的SCAP上调，MG132、CQ无明显作用，排除蛋白降解途径参与，确定铁通过提升SCAP翻译效率升高其蛋白水平。

3.4.2 多重分子实验证实IRP1特异性结合SCAP mRNA 5'UTR，铁过载促使二者解离

1.  生信筛选：交叉比对RNA结合蛋白数据库与铁代谢基因库，仅IRP1可靶向SCAP 5'UTR；分子对接预测IRP1蛋白与SCAP 5'UTR RNA存在稳定结合位点与氢键作用；

   
   

2.  RIP实验：内源性IRP1可富集SCAP 5'UTR片段，IgG阴性对照无富集，证明细胞内天然存在IRP1-SCAP mRNA复合物；

   
   

3. EMSA凝胶迁移实验：纯化重组IRP1蛋白可与SCAP 5'UTR探针形成迁移阻滞条带；50倍过量野生型冷探针可竞争性阻断结合，突变探针无竞争效应，证明二者结合具有序列特异性；

   
   

4. RNA pulldown、FISH-IF共定位：铁处理后，与SCAP 5'UTR探针结合的IRP1蛋白含量显著下降，荧光共定位信号减弱，直观证明高铁环境下IRP1与SCAP mRNA解离。

   
   

3.4.3 IRP1敲低直接激活SCAP-SREBP1通路，SCAP回补可逆转表型

1.  siRNA分别敲低IRP1、IRP2：敲低IRP1后SCAP蛋白、成熟mSREBP1、下游脂合成酶全部上调，FLSs迁移侵袭增强；敲低IRP2无明显表型变化，IRP2无法代偿IRP1功能；

   
   

2.  双敲低拯救实验：IRP1单敲低促进FLSs侵袭；同步敲低IRP1+SCAP后，SCAP缺失完全逆转IRP1沉默带来的SREBP1活化、细胞高侵袭表型。

   
   

该回补实验从遗传层面证实：SCAP是IRP1唯一功能性下游效应分子，铁信号严格沿IRP1→SCAP→SREBP1单向传递。

四、结论

1.  CML急变期出现超级增强子激活，驱动SOX4与SMAD3高表达。

   
   

2.  SOX4与SMAD3形成正反馈环路，稳定维持高表达。

   
   

3. 双重机制驱动急变：◦ 转录轴：直接激活AXL，启动AKT/ERK/STAT5致癌信号。◦ 代谢轴：激活LPCAT1，提高饱和磷脂水平，降低膜流动性，保证AXL定位于细胞膜并充分活化。

   
   

4.  AXL抑制剂Bemcentinib可有效阻断该轴，抑制CML急变，是潜在临床药物。

   
   

5. 该研究首次建立：SE→转录因子→磷脂代谢→膜受体定位→致癌信号的完整链条，为白血病急变机制提供全新范式。

   
   

五、创新点与临床价值

1.  核心创新点

   1.1首次建立关节局部铁过载→FLSs脂质代谢重编程→RA骨损伤完整因果轴；

   1.2 首次发现IRP1作为RNA结合蛋白调控SCAP翻译，揭示铁代谢与脂质合成直接交叉分子机制（IRP1-SCAP轴）；

   1.3 区分滑膜细胞对铁的异质性反应：巨噬细胞发生铁死亡，FLSs抵抗铁死亡并获得侵袭表型；

   1.4. 提出细胞特异性靶向策略，优于全身铁螯合治疗（避免系统性铁缺乏副作用）。

   
   

2.  机制延伸解读

   2.1 铁调控FLSs脂代谢双重途径：既促进从头脂合成，也上调LDLR增加外源胆固醇摄取；脂质为FLSs骨架重塑、基质降解提供原料与信号；

   2.2.IRP1双功能：低铁时为RNA结合蛋白抑制SCAP；高铁时转为顺乌头酸酶，失去RNA结合能力；IRP2无代偿效应；

   
   

3. 临床提示：RA合并贫血患者补铁需谨慎，会加重滑膜病变。

   
   

4.  治疗转化价值

   4.1.现有靶点：铁螯合剂DFO、SREBP1抑制剂（Fatostatin、EPA）；

   4.2.全新精准靶点：IRP1与SCAP 5'UTR的RNA-蛋白相互作用，可开发小分子/多肽阻断二者结合，特异性抑制FLSs致病脂质合成，不干扰全身铁稳态，副作用更低。

六、总论

类风湿关节炎病灶滑液亚铁蓄积是加重滑膜增生、骨软骨破坏的关键驱动因素。亚铁通过调控铁调节蛋白IRP1与SCAP mRNA 5'UTR的结合状态，上调SCAP蛋白表达，进而激活脂合成转录因子SREBP1，驱动FLSs脂质代谢重编程，赋予FLSs强增殖、侵袭类肿瘤特性。

IRP1–SCAP轴是连接局部铁过载与滑膜成纤维细胞脂质紊乱的核心分子枢纽，靶向该通路可抑制RA关节结构损伤，具备开发新型RA靶向疗法的巨大潜力。

作者使用伯信生物明星产品RNA pulldown、IF -FISH、RNA EMSA试剂盒以及Probe（分子探针）进行分子调控机制研究。

伯信好物推荐

RNA pulldown Kit

产品介绍：

蛋白质与RNA的相互作用是许多细胞生物学过程的核心，如蛋白质合成、mRNA 组装、病毒复制、细胞发育调控等，研究它们之间相互作用的分子机制对理解这些生物学过程非常重要。

RNA pulldown技术通过体外转录标记生物素的RNA探针耦联链霉亲和素标记的磁珠，实现了对RNA结合蛋白质（RBPs）的高效富集和鉴定。

伯信 RNA pulldown Kit分为：

Bes5102(S)   RNA pulldown kit    12T

Bes5102(M)   RNA pulldown kit    24T

Bes5102(N)  RNA pulldown kit    40T

实验原理：

针对目标区域设计生物素标记的特异性RNA探针偶联磁珠，并与细胞蛋白提取物孵育，蛋白分子与RNA探针特异性结合，经洗脱，得到目的RNA探针-蛋白质复合物。最后采用Western Blot或质谱鉴定蛋白质类型。

技术流程：

结果实例：

产品优势：

1. 自主品牌：拥有自主知识产权专利。

2. 高品质，稳定性好。

3. 精准：特异性高，背景少。

4. 易用：操作简单，容易上手。

5. 快速省时：全部实验只需3小时。

IF-FISH Kit

产品介绍：

伯信生物建立了荧光原位杂交探针（FISH Probe）制备平台，承接荧光原位杂交试剂盒定制业务，可根据客户需求进行个性化定制。该试剂盒主要用于检测样本中目的基因的表达量与表达部位，可应用于组织切片（石蜡切片/冰冻切片）、细胞爬片与染色体片等的检测。

伯信 IF-FISH Kit分为：

Bes1023(S) IF-FISH(短链) Kit     30T

Bes1023(N) IF-FISH(短链) Kit     50T

Bes1023(M) IF-FISH(短链) Kit     100T

Bes1024(S)     IF-FISH(长链) Kit     30T

Bes1024(N) IF-FISH(长链) Kit     50T

Bes1024(M) IF-FISH(长链) Kit     100T

Bes1025 (S)    IF-FISH试剂盒-protein&DNA     30T

Bes1025 (N)    IF-FISH试剂盒-protein&DNA     50T

Bes1025 (M)    IF-FISH试剂盒-protein&DNA     100T

实验原理：

荧光原位杂交（Fluorescent in situ hybridization, FISH）是根据待测核酸序列设计特异性的荧光素标记寡聚核苷酸探针，再经过共变性-退火-复性，使探针与靶DNA/RNA按照碱基互补配对原则形成杂交体。

最后利用荧光显微镜直接检测荧光信号，从而对组织、细胞中的待测核酸进行定性、半定量或相对定位分析的一种原位杂交技术。

免疫荧光（Immunofluorescence, IF）又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的，一项利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位示踪技术。

IF-FISH则整合了IF和FISH技术，可以同时示踪核酸分子与蛋白抗原分子在细胞内的相对定位。

技术流程：

结果实例：

产品优势：

1. 探针制备采用直接标记法，省去了信号放大系统。

2. 荧光信号强，结果判定直观可靠。

3. 根据客户需求定制个性化探针。

4. 特异性强，灵敏度高，背景低。

5. 探针性能稳定，低温保存一年以上。

6. 同时示踪核酸和蛋白的定位情况。

7. 操作简单，安全、快速，重复性好。

RNA EMSA

产品介绍：

凝胶迁移或电泳迁移率检测(Electrophoretic mobility shift assay，EMSA)是研究启动子结合蛋白的经典方法，主要应用于定性和定量分析核酸蛋白相互作用。

伯信 RNA EMSA Kit分为：

Bes5107(S) RNA EMSA Kit  12T

Bes5107(N) RNA EMSA Kit  100T

实验原理：

凝胶迁移或电泳迁移率检测(Electrophoretic mobility shift assay，EMSA)是研究启动子结合蛋白的经典方法，主要应用于定性和定量分析核酸蛋白相互作用。

针对目标区域设计特异性核酸探针，并进行末端生物素标记；该探针与蛋白质结合形成复合物，电泳时在凝胶中移动的速度慢（相对于没有结合蛋白的探针），即表现为条带相对滞后。

该方法不仅简单迅速、灵敏度高，还可以用竞争性试验来评价蛋白和核酸结合的特性。目前用于检测DNA/RNA结合蛋白，并可通过加入特异性抗体来检测特定的蛋白质，或是结合蛋白双向电泳与质谱技术鉴定分析未知蛋白。

RNA-EMSA是一种研究RNA结合蛋白（RBPs）和特定RNA序列之间结合作用的技术。本试剂盒提供了进行RNA-EMSA实验的主要试剂，包括蛋白提取、蛋白-RNA结合、电泳与化学发光等，使整体实验变得简单方便。

RNA-EMSA/Gel-Shift结合体系中含有poly(dI-dC)等有效成分，其中，poly(dI-dC)的浓度经过优化，可以很好地消除蛋白和标记探针间的非特异性结合，保证了实验检测的科学严谨性。此外，本试剂盒经去除RNA酶处理，一定程度上避免了实验过程中RNA降解。

技术流程：

产品优势：

1. 安全环保：采用非同位素的化学发光检测系统，免除放射性的危险与处理同位素废物的麻烦，减少环境污染；无需专门的同位素操作室，易于使用推广。

2. 高灵敏度：检测灵敏度高，背景干扰更低。

3. 快速省时：从标记探针到结果分析，全部实验只需5小时。

4. 稳定可靠：DNA末端标记生物素，不影响蛋白结合位点；标记好的DNA/RNA可以保存一年。

5. 配备完整：配备伯信生物细胞核提取试剂盒。

6. 个性化服务：可根据研究需要定制个性化高灵敏度探针。