A natural variation in rice susceptibility factor Rsf1 confers resistance to root-knot
nematode
《Nature Communications》（IF=18.096）
摘要
水稻根结线虫（RRKN ，即禾本科根结线虫 *Meloidogyne graminicola*）是一种具有破坏性的线虫，对全球水稻生产构成威胁。
目前关于抗 RRKN 资源的报道较少，其自然变异情况尚不十分明确。本研究通过全基因组关联分析（GWAS）、多组学分析及功能验证，鉴定了 RRKN 感病因子1（Rsf1）——该基因编码一种富含半胱氨酸的蛋白质。
通过联合分析研究（GWAS）、多组学分析及功能验证，我们发现 OsRsf1 蛋白的 TATA -盒区域存在自然变异：感病水稻种质携带单倍型（Hap）A，而抗病种质则携带 HapG。
携带 HapA 的 OsRsf1 蛋白表达量较高且可被 RRKN 感染诱导；而携带 HapG 的 OsRsf1 蛋白表达量较低，但赋予了更强的 RRKN 抗性。
我们进一步证实，转录因子 Myb44 可促进 OsRsf1 的表达。在水稻中敲除 OsRsf1 以及在拟南芥中敲除其直系同源基因 AtRsf1，均显著增强了对线虫的抗性，这表明该基因在功能上具有保守性。
OsRsf1基因的突变可在 RRKN 感染期间触发全身性防御反应。
本研究揭示了一种由Rsf1介导的、在 RRKN 感染中起作用的保守型易感性机制，为培育抗线虫作物提供了极具前景的靶点。
一、研究背景
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水稻根结线虫（RRKN）危害水稻根结线虫是破坏性极强的植物寄生线虫，全球水稻产区发生严重；中国年均受害面积大，产量损失可达2080%，水资源短缺、栽培制度变化进一步加重病害。植物寄生线虫每年造成全球801730亿美元经济损失。
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现有抗性局限传统育种多依赖R（抗病）基因，例如番茄Mi1.2、水稻MG1，但R基因数量少，大面积推广后线虫容易克服抗性。感病S基因编辑是抗病育种新策略，但水稻中已报道抗RRKN的S基因十分有限。
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病原可劫持宿主S基因：通过改变细胞结构、调控营养转运、抑制免疫帮助自身侵染；线虫分泌效应子重编程宿主细胞，建立取食位点。
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GWAS是解析水稻抗RRKN遗传基础的有力工具，但已发掘的抗性位点仍有限。
二、材料与表型筛选
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利用CRDPII的345份水稻种质开展大田抗RRKN鉴定，该群体包含香稻、aus、籼稻、温带粳稻、热带粳稻。
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抗性表型呈正态分布：仅9份抗病、142份中抗、139份中感、54份感病、1份高感；不同亚群整体抗性无显著差异。筛选得到两份高抗材料KPM18、PTB30，以及已知抗性材料ZH11，温室接种验证根结数量显著低于感病对照日本晴NPB。
三、结果
第一部分： Rsf1与RRKN抗性紧密关联
1）：345份CRDPII水稻种质大田抗性筛选
• 处理：连续多年RRKN重病田，调查根结指数(gall index)，群体包含5个水稻亚群：香稻、aus、籼稻、温带粳稻、热带粳稻。
• 结果
1）抗性属于数量性状，表型呈正态分布；绝大多数材料为中抗/中感，真正抗病材料极少；各亚群平均抗性没有显著差异，说明抗性不简单归属于某一个亚群。
2）筛选获得高抗种质KPM18、PTB30，ZH11作为已知抗病对照；感病对照日本晴NPB。温室接种，抗病材料根结指数、根结数量显著低于NPB，酸性品红染色显示抗病根内线虫发育受抑制。
• 分析RRKN抗性是多基因控制的数量性状，单纯依靠现有自然种质资源抗性材料稀缺，需要GWAS挖掘遗传位点。
2）：GWAS定位抗性位点
• 处理：673 494个SNP标记，CMLM、BLINK模型进行GWAS。
• 结果：得到358个显著SNP，划分为18个抗性位点LARRKN；3个位点和前人报道QTL重合，LARRKN8（7号染色体）信号最强，全新位点，无已报道抗性QTL重叠。
• 分析：LARRKN8是研究核心，区间4.5 Mb，包含175个蛋白编码基因。
3）：多组学缩小候选基因• 处理：NPB（感病）接种RRKN 3 dpi，RNAseq看LARRKN8区间基因表达变化。
• 结果：4个硫素样（thioninlike）富含半胱氨酸基因显著上调，其中Rsf1的FPKM表达水平最高。
• 转基因功能验证
1）过表达：分别构建5个候选基因过表达载体转入NPB。只有Rsf1_Hap3OE、Thil50OE植株根结显著增多，感病性上升；其余基因过表达无表型。
2）蛋白组：RRKN侵染后，只有Rsf1蛋白水平显著上调；Rsf1定位于细胞膜。
3）CRISPR敲除Rsf1，获得3个独立移码突变纯合株系Rsf1KO。KO株系根结数量、线虫数量显著下降，抗性显著提高，植株生长发育正常。
• 推论：LOC_Os07g24830即为目标感病基因，命名为Rsf1；该基因功能是促进RRKN侵染。第二部分：Rsf1启动子TATAbox的自然变异决定基因表达水平
1）：抗病/感病材料Rsf1表达差异
• 处理：不接虫、接虫后不同时间点，检测NPB(HapA，感病)、KPM、PTB30(HapG，抗病)根系Rsf1转录水平。
• 结果
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无侵染：NPB本底Rsf1就显著高于抗病材料。
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RRKN侵染后：NPB中Rsf1进一步被诱导上调；KPM、PTB30始终维持极低表达，不受线虫诱导。
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扩大群体：12份感病、17份抗病材料验证，趋势一致；接虫3 dpi感病材料表达量是抗病材料6.1倍。
• 分析：抗性差异来源于转录水平差异，不是蛋白编码区，推测启动子变异起决定性作用。
2）：单倍型、连锁不平衡LD分析• 处理：测序12抗+12感材料Rsf1全长（启动子+编码区+UTR），共得到31个SNP。
• 结果SNP14118000位于TATAbox核心序列：LD显示SNP14118000与邻近SNP强连锁；双荧光素酶报告实验：仅该TATAbox位点改变直接改变启动子活性，另一个连锁SNP无作用；HapA启动子活性显著高于HapG。
3）：地理分布与进化分析• 结果1.HapG种质地理分布与RRKN病害严重发生区域高度吻合（R^2=0.767，P<0.0001）；HapG主要存在于籼稻与普通野生稻。
2.Fst、Nm基因流分析：普通野生稻与栽培籼稻之间Rsf1基因交流少；Tajima’s D中性检验表明该基因驯化过程经历纯化选择。
• 推论：在RRKN长期胁迫的热带亚热带稻区，HapG低表达单倍型被保留。
第三部分： 转录因子Myb44直接调控Rsf1的转录
1)：DNApulldown + LCMS质谱筛选互作转录因子
• 处理：生物素标记Rsf11000 bp启动子，抓取RRKN侵染0/1/3 dpi水稻根部核蛋白，SDSPAGE，质谱鉴定结合蛋白。
• 结果：筛选得到转录因子Myb44（LOC_Os06g14010）。
2)：EMSA凝胶迁移
• 结果：Myb44蛋白直接结合Rsf1启动子TAACCA顺式元件；HapA/HapG的TATAbox变异不影响Myb44与DNA的结合能力。
3)：原生质体双荧光素酶激活实验
• 处理：效应子Myb44；报告载体分别为HapA、HapG型Rsf1启动子驱动LUC。
• 结果：Myb44能够激活Rsf1启动子；HapG的激活强度只有HapA的1/3.7。
• 解释：Myb44结合位点不在TATAbox；TATAbox变异影响RNA聚合酶复合体招募，虽然Myb44可以结合DNA，但下游转录输出大幅下降。
4)：Myb44敲除株系功能验证（CRISPR）
• 结果
1）Myb44KO植株生长无异常；接虫后Rsf1诱导表达显著下降。
2）Myb44KO根结、线虫数量显著降低，RRKN抗性提升。
• 完整调控链：RRKN侵染诱导Myb44表达→Myb44结合Rsf1启动子→HapA背景高效激活Rsf1高表达，促进感病；HapG背景TATAbox突变，转录激活效率下降，Rsf1低表达，抗病。
第四部分：Rsf1促进线虫寄生的生理表型解析
1.体外线虫活性实验
• 处理：纯化Rsf1GST重组蛋白体外处理J2幼虫。
• 结果：Rsf1蛋白不会直接杀死线虫，不影响线虫活力。说明作用是间接调控植物宿主，不是直接杀虫。
2)线虫趋化（吸引）实验
• 处理：分区间检测野生型与Rsf1KO根系对J2幼虫吸引能力。
• 结果：Rsf1KO植株根附近01.5 cm区域，线虫数量下降61.37%。
• 推论：Rsf1缺失改变根系分泌物/根表特性，降低根系对线虫的吸引，减少线虫向根部迁移。
3)线虫体内发育统计
• 处理：接种后14 dpi，染色统计根内线虫发育阶段（J3、J4、雌成虫）。
• 结果：WT和Rsf1OE大量线虫发育为J4和雌虫；Rsf1KO大量线虫停滞J3阶段，无法完成发育。
• 推论：即使线虫成功侵入根内，Rsf1敲除依然阻碍线虫完成生活史。
4)重病田大田产量试验
• RRKN发病大田条件1.Rsf1KO根结数降低63.68%；野生型产量损失25.01%，敲除株挽回16.12%产量损失。
• 无病害大田条件2.WT、Rsf1OE、Rsf1KO株系株高、分蘖、穗粒数、粒重等全部农艺性状无显著差异。
• 关键结论：编辑Rsf1获得抗性不存在产量代价，对育种极为有利。
第五部分：Rsf1敲除激活植物广谱防御应答
1.转录组RNA seq
• 处理：WT、Rsf1KO、Rsf1OE，接虫3 dpi、7 dpi取样，差异基因DEG分析，GO、KEGG富集。
• 结果：Rsf1KO产生828个差异基因；KEGG显著富集：植物病原互作通路、MAPK信号通路。
2.RTqPCR验证防卫基因
• 结果：OsMAPK5、OsPR1、OsPR1b、OsPR10a等防卫标记基因，在Rsf1KO与Myb44KO中显著上调。
3.胼胝质沉积测定
• 结果：胼胝质合成基因OsUGE3上调；Rsf1KO根结处胼胝质沉积面积显著高于野生型。胼胝质可以加固细胞壁，阻碍线虫取食位点构建。
4.激素相关基因表达热图
• 结果：SA通路OsNH1、乙烯通路OsERF3、OsACS1显著上调。
• 综合机理推论：Rsf1作为感病因子，功能是抑制植物基础免疫；敲除后解除免疫抑制，MAPK、PR基因、细胞壁胼胝质、SA/ET激素防御网络整体被激活，实现抗性。
5. Rsf1功能保守性：拟南芥同源基因AtRsf1（双子叶）
• 处理：获取AtRsf1 TDNA插入突变体，接种RRKN。
• 结果：突变体根结下降53.46%，线虫数目下降51.48%；植株生长发育不受影响。
• 推论：Rsf1是单/双子叶保守的线虫感病因子；该基因编辑策略有拓展到其他作物的潜力。
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创新点、应用前景
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创新：本研究报道植物半胱氨酸富集蛋白Rsf1被线虫诱导，作为感病因子促进线虫侵染；以往研究多关注植物硫素蛋白抗病，本研究揭示该家族成员可充当感病因子。
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TATAbox自然变异调控基因表达进而调控病害抗性，是作物对病原共进化的一种模式；HapG单倍型在RRKN高发区域富集，但该变异的演化机制仍待深入研究。
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育种价值：通过基因编辑敲除Rsf1，可以获得高抗RRKN水稻，不带来产量损失；由于该基因功能在植物中保守，为其他作物抗根结线虫育种提供候选基因。
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待解决问题：
◦ HapG单倍型的演化选择机制；
◦ Rsf1具体抑制免疫的分子生化机理；
◦ Rsf1同源基因在更多作物中的功能保守性；◦ SA、ET激素通路在Rsf1介导抗性中的精细作用。
六、关键实验技术
包含大田与温室线虫接种、GWAS分析、DNApulldown+LCMS、EMSA、双荧光素酶、CRISPR基因编辑、转录组RNAseq、胼胝质染色、线虫趋化与发育观察、亚细胞定位、群体进化分析、大田产量鉴定等。
七、结论
综上所述， RRKN 可诱导植物中 CRP 基因Rsf1的表达，从而促进其寄生作用；而Rsf1启动子区中 TATA 框的自然变异可增强水稻对线虫的抗性；靶向Rsf1基因编辑技术能显著提升水稻对线虫的抗性，且不降低产量。
这些发现揭示了由Rsf1介导的 RRKN 感染所涉及的一种保守作用机制，并表明Rsf1是培育抗线虫作物品种的潜在候选基因。
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