EIF4A3 modulated circ_000999 promotes epithelial-mesenchymal transition in cadmium-induced malignant transformation through the miR-205-5p/ZEB1 axis 

《Environment International》（IF=10.3005）

镉（Cd）是一种累积的有毒金属，对人类健康构成严重威胁，即使是微量的。在肺癌（LC）的病理生理学中，最重要的步骤之一是上皮间充质转化（EMT）。

在本研究中，将人支气管上皮细胞（16HBE）暴露于低剂量Cd30周，建立了高表达环状（circ_000999）RNA的细胞恶性转化模型。cd诱导的EMT在大鼠肺和16HBE细胞中明显观察到EMT，并在过表达circ_000999后进一步增强。

此外，上调的EIF4A3与亲本基因AGTPBP1相互作用，促进circ_000999的高表达。随后的实验证实，circ_000999可以通过竞争性结合miR-205-5p并抑制其活性来调控EMT过程，从而上调锌指E-box结合蛋白1（ZEB1）的表达。

重要的是，LC组织中circ_000999的表达水平显著升高，与EMT指标有很强的相关性。总之，这些发现为逆转肺EMT及LC的后续治疗和预防提供了新的目标和研究方向。

用5 μM氯化镉在30周内培养16HBE细胞。我们通过细胞迁移实验、克隆形成实验和软琼脂实验来检测细胞是否发生了恶性转化。治疗30周后，16HBE细胞显示出明显更大的迁移，增加16HBE细胞产生的克隆数量。

此外，在软琼脂中，Cd处理后形成的细胞克隆数量明显高于对照细胞的克隆数量。MMP2属于锌依赖的内肽酶家族，与恶性转化密切相关，我们检测了暴露于Cd10、20和30周的细胞中MMP2的表达。

MMP2的mRNA和蛋白表达水平均显著升高。这些结果证实了慢性暴露于Cd可导致细胞的恶性转化。在Cd暴露10、20和30周后，我们评估了细胞中e-钙粘蛋白和非钙粘蛋白的含量。

在处理后的16HBE细胞中，E-cadherin蛋白含量比对照组明显降低，而N-cadherin蛋白表达增加。这些发现表明，暴露于Cd导致16个HBE细胞发生恶性转化，而EMT发生在这一阶段。

通过RNA测序，我们鉴定了15个表达水平有显著变化的环状rna。在cd暴露组和对照组之间，circ_000999的表达有显著差异。为了验证环状特征，总RNA是否用RNase R处理。

线性GAPDH和AGTPBP1被降解，而circ_000999没有被降解，表明circ_000999对RNase R具有抗性。采用catRAPID方法预测EIF4A3、QKI和AGTPBP1的蛋白-rna配对的结合倾向。

同时，westernblotn检测结果显示，16HBE细胞中QKI和EIF4A3的表达水平显著升高。利用circ_000999的亲本基因AGTPBP1的义链和反义链，研究了EIF4A3、QKI和AGTPBP1之间的相互作用。

RNA下拉和RIP检测结果显示，AGTPBP1可以与EIF4A3结合，但不能与QKI结合。然后，我们使用环状交互组计算工具计算出AGTPBP1有三个与EIF4A3兼容的结合位点(图。S4)。

综上所述，EIF4A3在Cd诱导的EMT过程中调控circ_000999的高表达。

我们进一步探讨了circ_000999在EMT过程中的具体特征，这是cd诱导的细胞恶性转化的早期阶段。在瞬时转染的16HBE细胞中，两种sirna对circ_000999的干扰率分别为33.1 %和54.3%。用过表达载体circ_000999（OE）或VEC转染cd暴露的16HBE细胞。

OE组中circ_000999的表达量几乎高出了40倍。circ_000999表达下调后，E-钙粘蛋白基因和蛋白含量显著升高，而n-钙粘蛋白含量明显降低。

同时，过表达circ_000999后，e-钙粘蛋白的mRNA和蛋白水平均有所下降，而n-钙粘蛋白的表达水平有所增加。这些结果表明，circ_000999参与了cd诱导的恶性肿瘤过程中EMT的控制。

环状rna作为海绵吸附剂调节miRNAs，利用TargetScan算法预测circ_000999的靶miRNAs，发现了5个与cd诱导的EMT密切相关的miRNAs。

cd暴露的细胞中miR-205-5p的表达显著降低。然后，我们研究了miR-205-5p如何影响暴露于Cd的16个HBE细胞的EMT。

当将miR-205-5p mimic转染到16HBE细胞中时，转染效率提高了约15倍。过表达miR-205-5p后，E-钙粘蛋白的基因和蛋白表达水平升高，而n-钙粘蛋白的表达水平下降。

这些结果表明，过表达miR-205-5p可抑制16HBE细胞中的EMT。

我们通过westernblot检测了10、20和30周时cd暴露细胞中ZEB1的蛋白水平。ZEB1蛋白水平明显升高。

此外，将miR-205-5p mimic转移到Cd处理10周的16HBE细胞中，与NC组相比，ZEB1的基因和蛋白表达明显降低。

以上实验表明，miR-205-5p通过ZEB1抑制cd暴露细胞的EMT过程。

根据FISH和细胞质核和细胞质RNA的分离结果，Circ_000999主要定位于细胞质中。为了证实circ_000999与miR-205-5p结合，我们在293-T细胞中共转染了circ_000999野生型（WT）或突变型（MUT）和miR-205-5p mimic。

双荧光素酶报告基因分析显示，circ_000999 wt的荧光素酶活性略低。接下来，我们观察了改变circ_000999表达后对miR-205-5p表达的影响。

结果表明，与NC组相比，抑制circ_000999导致miR-205-5p的表达显著上调。同时，过表达circ_000999显著降低了miR- 205-5p的表达。

为了阐明circ_000999在细胞诱导EMT中的确切机制，我们将circ_000999 OE和miR-205-5p模拟物共转染了16HBE细胞。结果表明，共转染可减轻了miR-205-5p对ZEB1的抑制作用。

接下来，我们推测circ_000999通过转录因子ZEB1促进了cd诱导的EMT的进展。与NC组相比，siRNA-2在转染的16HBE细胞中对ZEB1的干扰率为39.4%。

我们观察到共转染circ_000999 OE和siRNA-2后，结果发现，当ZEB1被抑制后，circ_000999 OE对e-钙粘蛋白和n-钙粘蛋白的调节作用降低。

这些发现表明，circ_000999通过miR-205-5p/ZEB1轴增强了cdiniced诱导的EMT。

采用单次气管输注Cd建立肺损伤模型，观察肺损伤和纤维化的程度。采用Masson染色检测结果显示，大鼠肺纤维化程度随着暴露时间的增加而增加。

气管输注Cd后28天的免疫荧光分析显示，暴露的肺组织中e-钙粘蛋白的荧光强度在蛋白水平上降低，而n-钙粘蛋白的荧光强度升高。

大鼠肺组织中E-cadherin mRNA的表达低于对照组。相反，n-钙粘蛋白mRNA的表达有较高的表达倾向。在Cd暴露的大鼠肺组织中，与对照组相比，miR-205-5-5p含量呈下降趋势，7、14、28天肺组织中ZEB1含量呈上升趋势。

此外，circ_000999的表达与暴露大鼠肺组织中ZEB1和n-钙粘蛋白的含量呈正相关，但与e-钙粘蛋白的表达呈负相关。

综上所述，Cd诱导了肺组织损伤，而circ_000999在这一过程中显著增加，并参与了体内由Cd引起的EMT的调节。

我们测定了20例人LC及邻近组织中Circ_000999、miR-205-5p和ZEB1的表达水平。qRT-PCR结果显示，circ_000999和ZEB1在LC组织中的表达水平升高，而miR-205-5p的表达水平低于邻近组织。

与邻近组织相比，LC组织中E-钙粘蛋白水平显著降低，N-cadherin水平明显升高。后续的分析集中于circ_000999与EMT指标之间的相关性。

我们的研究结果显示，在人肺组织中，ZEB1和n-钙粘蛋白的表达与circ_000999的表达呈正相关，而e-钙粘蛋白的表达呈负相关。

这些结果表明，EMT过程发生在人LC组织中，且circ_000999的高表达与EMT指标密切相关。

总之，我们已经证实了低剂量Cd暴露可诱导恶性转化过程中EMT的发生。EIF4A3调节的circ_000999通过miR-205-5p/ ZEB1轴促进cd诱导的EMT。这些结果为LC的诊断提供了一个全新的靶点。

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