CircROR1 binds HNRNPL to regulate FOXO4 pre-mRNA splicing, promoting cutaneous melanoma metastasis and serving as a therapeutic target via RNAi-loaded PEG-LNPs

（IF=33.8990）《Molecular Cancer》

摘要

皮肤黑色素瘤（cutaneous melanoma, CM）恶性程度高、易早期转移且对免疫治疗易产生耐药，亟需新的分子靶点与治疗策略。

环状 RNA（circRNA）可通过结合 RNA 结合蛋白调控 mRNA 可变剪接，在肿瘤进展中发挥关键作用。

本研究旨在鉴定黑色素瘤中异常表达的 circRNA，并阐明其调控肿瘤转移的分子机制，同时开发靶向纳米药物用于治疗。

通过芯片筛选与临床样本验证，发现 circROR1（hsa_circ_0000082） 在转移性黑色素瘤中显著高表达，且与肿瘤转移及不良预后正相关。

功能实验表明，circROR1 在体外促进黑色素瘤细胞增殖、迁移、侵袭与上皮-间质转化（EMT）并抑制凋亡；在体内加速肿瘤生长并促进肺定植转移，同时通过下调 PD-L1 介导抗 PD-L1 免疫治疗耐药。

机制上，RNA pull-down、质谱及 RIP 实验证实 circROR1 直接结合剪接因子 HNRNPL，增强其蛋白稳定性并抑制核转位，进而调控 FOXO4 前体 mRNA 可变剪接，使抑癌亚型 FOXO4α 减少、促癌亚型 FOXO4ζ 增加。

回复实验证实，过表达 FOXO4α 可逆转 circROR1 的促转移效应。在此基础上，本研究构建 叶酸修饰 PEG 化脂质纳米颗粒 FA-PEG(si-circ)，实现对 circROR1 的高效、稳定、靶向沉默。

该纳米药物在体内显著抑制黑色素瘤肺转移，生物相容性好、安全性高。

综上，circROR1/HNRNPL/FOXO4 剪接轴是驱动黑色素瘤转移的关键通路，circROR1 可作为转移性黑色素瘤的诊断标志物与治疗靶点，FA-PEG(si-circ) 为晚期黑色素瘤提供了具有临床转化前景的新型靶向治疗策略。

一、引言

皮肤黑色素瘤是高度恶性的皮肤肿瘤，具有早期转移、预后差、五年生存率低等特点。尽管靶向治疗与免疫检查点治疗取得进展，但耐药与远处转移仍是治疗失败的主要原因。

因此，揭示黑色素瘤转移的核心分子机制、发掘新型诊疗靶点具有重要临床价值。环状 RNA（circRNA）由前体 mRNA 反向剪接形成，结构稳定、组织特异性强，可作为分子海绵、调控转录、影响 mRNA 剪接等。

近年来研究表明，circRNA 通过结合剪接因子调控下游基因可变剪接，成为肿瘤转移调控的新范式。然而，circRNA-RBP-剪接轴在黑色素瘤中的作用仍不明确。

本团队前期发现 circROR1 在黑色素瘤中异常高表达，但其功能、机制及治疗价值尚未阐明。

据此提出科学假说：circROR1 可能通过结合剪接因子 HNRNPL 调控 FOXO4 剪接，进而促进黑色素瘤侵袭转移。本研究围绕该假说展开系统研究，旨在为黑色素瘤提供新机制、新标志物与新疗法。

二、材料与方法

2.1 临床组织样本与细胞：收集黑色素瘤组织、癌旁组织及痣组织；细胞株包括 HEM、WM35、WM451、A375、A2058、B16 及 HaCaT。

2.2 分子生物学实验：qRT-PCR、RNase R 处理、放线菌素 D 稳定性检测、核质分离、FISH、RNA pull-down、质谱、RIP、Western blot。

2.3 细胞功能实验：CCK-8、克隆形成、划痕愈合、Transwell 迁移与侵袭、流式细胞术凋亡检测。

2.4 动物模型：C57BL/6 小鼠皮下移植瘤模型、尾静脉肺定植模型；裸鼠 Luc-A375 肺转移模型与活体成像。

2.5 纳米药物制备与评价：微流控制备 FA-PEG(si-circ)；凝胶阻滞、TEM、血清稳定性、细胞摄取、活体分布、组织病理学检测。

2.6 生物信息学与统计分析：差异表达分析、GO/Reactome 富集、RBPmap 预测、TCGA/GEO 数据集分析；统计学采用 t 检验、ANOVA 等，P<0.05 为差异具有显著性。

三、结果

3.1 circROR1 在转移性黑色素瘤中高表达且结构稳定

芯片筛选显示 circROR1 在高转移黑色素瘤细胞中显著上调。临床样本证实，circROR1 在黑色素瘤组织中高于正常组织与痣组织，转移灶显著高于原发灶，与 AJCC 分期及转移状态显著相关。

circROR1 由 ROR1 基因 2、3 号外显子反向剪接形成，抗 RNase R 降解、半衰期长，定位于细胞核与细胞质，符合剪接调控分子的定位特征。

3.2 circROR1 促进黑色素瘤增殖、侵袭、EMT 并介导免疫耐药

过表达 circROR1 可促进细胞增殖、克隆形成、迁移与侵袭，激活 EMT（N-cadherin、Vimentin、Snail 上调，E-cadherin 下调），抑制凋亡；敲低则表型逆转。

体内实验显示，circROR1 促进皮下肿瘤生长与肺转移结节形成。同时，circROR1 下调 PD-L1 表达，降低黑色素瘤对 PD-L1 抗体治疗的敏感性，介导免疫耐药。

3.3 circROR1 直接结合并调控 HNRNPL 表达与核转位

RNA pull-down 联合质谱筛选到剪接因子 HNRNPL。RIP 实验证实二者直接结合。circROR1 可增强 HNRNPL 蛋白稳定性，并将其滞留于细胞质，减少核内分布。

临床组织中 circROR1 与 HNRNPL 表达呈正相关。

3.4 circROR1/HNRNPL 调控 FOXO4 前体 mRNA 可变剪接

生物信息学与验证表明FOXO4 是 HNRNPL 的关键剪接底物。FOXO4 存在两种主要亚型：FOXO4α（全长、抑癌）与 FOXO4ζ（内含子剪切、促癌）。

circROR1 过表达或 HNRNPL 敲低均导致：• FOXO4α 减少、FOXO4ζ 增加

• FOXO4 总蛋白水平下降回复实验显示，FOXO4α 过表达可逆转 circROR1 诱导的侵袭与 EMT，证实 FOXO4 为关键效应分子。

3.5 FA-PEG(si-circ) 纳米药物靶向抑制黑色素瘤转移

构建叶酸靶向纳米递送系统 FA-PEG(si-circ)，粒径均一、包载效率高、血清稳定性强、肿瘤靶向性好。

体外可高效沉默 circROR1 并抑制细胞恶性表型；体内可显著减少肺转移结节、降低活体荧光信号，对主要脏器无明显损伤，安全性良好。

此外，circROR1 在膀胱癌、结直肠癌、舌鳞癌等多种肿瘤中高表达，提示该策略具有泛癌治疗潜力。

四、讨论

本研究首次系统揭示 circROR1/HNRNPL/FOXO4 可变剪接轴在皮肤黑色素瘤转移中的关键驱动作用，并完成从机制解析到靶向纳米药物的完整转化链条。

首先，本研究明确 circROR1 是黑色素瘤的促癌 circRNA，其高表达与转移、免疫耐药密切相关，可作为独立预后标志物。

其次，本研究阐明了全新分子机制：circROR1 作为分子海绵结合 HNRNPL，调控其核质分布与蛋白稳定性，进而重编程 FOXO4 剪接，使抑癌亚型减少、促癌表型增强。

该机制将 circRNA、剪接因子、mRNA 可变剪接与肿瘤转移有机串联，丰富了非编码 RNA 调控肿瘤恶性进展的理论体系。

同时，本研究发现 circROR1 下调 PD-L1 并介导免疫耐药，提示其可作为联合免疫治疗的预测标志物与增敏靶点，为克服耐药提供新思路。

在转化层面，本研究构建的 FA-PEG(si-circ) 纳米药物具备靶向富集、高效沉默、稳定安全等优势，在体内显著抑制肺转移，为晚期黑色素瘤提供了可转化的新型 RNAi 治疗策略。

本研究仍存在一定局限：未深入解析 HNRNPL 与 FOXO4 前体 mRNA 的精确结合位点；FOXO4ζ 的具体功能有待进一步阐明；动物模型以实验性转移为主，未来可开展自发转移模型与临床前大动物验证。

综上，circROR1 是黑色素瘤转移的关键驱动因子与治疗靶点，circROR1/HNRNPL/FOXO4 轴可为黑色素瘤机制研究与精准干预提供全新方向，靶向 circROR1 的纳米疗法有望成为转移性黑色素瘤的重要治疗手段。

五、结论

1,circROR1 在转移性皮肤黑色素瘤中特异性高表达，是促进肿瘤增殖、EMT、远处转移及免疫耐药的致癌环状 RNA。

2. 分子机制：circROR1 直接结合剪接因子 HNRNPL，抑制其核转位并增强稳定性，进而调控 FOXO4 前体 mRNA 可变剪接，降低抑癌亚型 FOXO4α 表达，最终驱动肿瘤转移。

3. 治疗价值：叶酸靶向纳米药物 FA-PEG(si-circ) 可高效、安全地沉默 circROR1，显著抑制黑色素瘤肺定植，是极具前景的抗转移新型疗法。

4. circROR1 可作为皮肤黑色素瘤转移诊断标志物、预后评估指标与精准治疗靶点。

作者使用伯信生物明星产品RNA pulldown、RIP试剂盒进行分子调控机制研究。

RNA pulldown

产品介绍：

蛋白质与RNA的相互作用是许多细胞生物学过程的核心，如蛋白质合成、mRNA 组装、病毒复制、细胞发育调控等，研究它们之间相互作用的分子机制对理解这些生物学过程非常重要。

RNA pulldown技术通过体外转录标记生物素的RNA探针耦联链霉亲和素标记的磁珠，实现了对RNA结合蛋白质（RBPs）的高效富集和鉴定。

伯信 RNA pulldown Kit分为：

Bes5102(S)   RNA pulldown kit    12T

Bes5102(M)   RNA pulldown kit    24T

Bes5102(N)  RNA pulldown kit    40T

实验原理：

针对目标区域设计生物素标记的特异性RNA探针偶联磁珠，并与细胞蛋白提取物孵育，蛋白分子与RNA探针特异性结合，经洗脱，得到目的RNA探针-蛋白质复合物。最后采用Western Blot或质谱鉴定蛋白质类型。

技术流程：

结果实例：

产品优势：

1. 自主品牌：拥有自主知识产权专利。

2. 高品质，稳定性好。

3. 精准：特异性高，背景少。

4. 易用：操作简单，容易上手。

5. 快速省时：全部实验只需3小时。

RIP试剂盒

产品介绍：

RNA Immunoprecipitation（RIP）是研究细胞内RNA与蛋白质结合的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，可应用于miRNA调控靶点、RNA 与 RBPs（RNA结合蛋白）互作等研究。

伯信 RIP Kit分为：

Bes5101(S)    RIP Kit       12T

Bes5101(M)    RIP Kit       24T

Bes5101(N)    RIP Kit       40T

实验原理：

RIP技术运用针对目标蛋白的抗体免疫沉淀相应的RNA-蛋白复合物，并纯化与蛋白结合的RNA。最后，结合基因特异性分析技术（PCR、qRT-PCR）或高通量分析技术（高通量测序、基因芯片），分析结合在复合物上的RNA类型及数量。

技术流程：

结果实例：

产品优势：

1. 伯信独立研发。

2. 提供优化的磁珠，适于免疫沉淀RNA-蛋白复合物。

3. 高品质，稳定性好，

4. 结果准确，重复性好。

5. 操作简单，快速省时。