摘要：

肺癌是全球导致癌症相关死亡的主要原因。长链非编码rna（lncRNAs）已成为癌症发生发展的关键调控因子，并成为癌症诊断和预后的很有前途的生物标志物。在本研究中，我们发现了一种新的lncRNA（LINC02159），该基因在非小细胞肺癌（NSCLC）患者的肿瘤组织和血清中表达上调。我们发现，敲除LINC02159可以抑制NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭，但在体外诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞，在体内延缓肿瘤生长，而过表达LINC02159则导致相反的效果。

通过转录组学分析，我们发现LINC02159与肿瘤的生长和转移相关通路高度相关，并且YAP1是LINC02159的潜在靶基因。在机制上，LINC02159与Aly/ REF输出因子（ALYREF）结合，通过m5 C修饰增强YAP1信使RNA（mRNA）的稳定性，导致NSCLC细胞中YAP1的过表达和Hippo和β-连环蛋白信号通路的激活。救援实验表明，LINC01259以YAP1-和ALYREF依赖的方式促进了NSCLC的进展。

综上所述，LINC02159通过调控ALYREF/YAP1信号通路在NSCLC进展中发挥致癌作用，有可能作为NSCLC的诊断标志物和治疗靶点。

研究团队使用NSCLC患者中匹配的肿瘤组织和邻近的非肿瘤组织进行了RNA测序。RNA测序结果显示，肿瘤组织中有84个lncRNAs上调，89个lncRNAs下调。我们选择了LINC02159进行进一步的研究，因为它到目前为止还没有在癌症中进行研究。

我们证实，与HBE细胞相比，人NSCLC细胞系（A549、H1299和PC9）中LINC02159的表达上调。qRT-PCR结果显示，LINC02159在72%的肿瘤组织中的表达水平高于邻近非肿瘤组织。与肺炎患者和健康个体相比，NSCLC患者血清中LINC02159的表达显著上调。

为了揭示LINC02159在NSCLC中的生物学功能，我们进行了功能缺失研究，下调LINC02159显著抑制了NSCLC细胞的增殖（图2b和C）。在NSCLC细胞中下调LINC02159可诱导凋亡细胞数量增加。为了进一步验证LINC02159在NSCLC进展中的作用，我们建立了体内小鼠皮下异种移植瘤模型。

我们发现，LINC02159基因敲低组的小鼠肿瘤的体积和体重均小于对照组（图2J）。LINC02159基因敲低组小鼠肿瘤组织中增殖的肿瘤细胞数量减少，凋亡细胞数量增加（图2K）。

另外下调LINC02159基因提高了NSCLC细胞对DDP/5-FU处理的敏感性。LINC02159基因敲低降低了吉非替尼和厄洛替尼的半抑制浓度值。这些结果表明，LINC02159在NSCLC的进展中发挥了致癌作用。

为了了解LINC02159在NSCLC中的致癌作用机制，我们进行了TRAP实验来鉴定与LINC02159相互作用的蛋白，因为它已被证明主要定位于细胞核（图3A-D）。质谱分析结果显示，与MS2组相比，LINC01259-MS2组中富集了几种蛋白。

我们选择了ALYREF来进行下面的研究，因为它有最高的倍数变化。我们通过另一种独立的TRAP检测方法验证了LINC01259和ALYREF的结合（图3E）。RIP检测结果证实，LINC02159在NSCLC细胞中的ALYREF-免疫沉淀复合物中富集（图3F）。我们分析了ALYREF蛋白在NSCLC患者的肿瘤组织和非肿瘤组织中的表达，发现ALYREF蛋白为在93%的肿瘤组织中高表达，同时升高的肿瘤组织中高表达（图3L）。

这些发现表明，LINC02159可能通过与ALYREF相互作用在NSCLC中发挥促肿瘤作用。

LYREF作为m5 C修饰的解读器，调节mRNA的加工和核输出。TCGA数据分析结果显示，与非肿瘤组织相比，NSCLC患者肿瘤组织中ALYREF显著上调，生存时间分析结果显示，高水平的ALYREF预示着NSCLC患者的整体预后较差（图4C）。

ALYREF敲低降低了NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导了细胞凋亡和细胞周期阻滞（图4D-K）。ALYREF基因敲低增加了e-钙粘蛋白的表达，而降低了n-钙粘蛋白和波形蛋白以及Slug和Snail等EMT转录因子的表达（图4M）。

此外，ALYREF敲低不仅提高了NSCLC细胞对DDP/5-FU处理的敏感性，而且还降低了吉非替尼和厄洛替尼的半抑制浓度值（图S3）。这些结果表明ALYREF在NSCLC中上调，并作为致癌基因促进NSCLC进展。

我们想了解在NSCLC中受LINC02159调控的下游基因和信号通路。采用RNA测序方法分析LINC02159敲低的NSCLC细胞中改变的基因。KEGG富集分析结果显示，LINC02159基因敲低影响了许多与癌症相关的通路，我们将重点放在YAP1上，因为下调LINC02159降低了其在NSCLC细胞中的基因表达（图5E）。

既往研究表明，YAP与TEAD转录因子相互作用，qRT-PCR检测了LINC02159和ALYREF敲低对这些靶基因的影响。结果显示，与对照组相比，在LINC02159-、ALYREF-和yap1-敲低组中，Hippo通路靶基因的表达显著降低，表明LINC02159通过YAP1调控TEAD活性（图5j、K、S7）。

然后，我们通过使用一对针对ALYREF的3‘-UTR结合位点的引物来确定ALYREF和YAP1 mRNA的相互作用。RIP结果显示，在NSCLC细胞中，YAP1 mRNA在ALYREF-免疫沉淀复合物中富集（图5L）。这些结果表明，LINC02159通过ALYREF介导的m5 C修饰调控YAP1 mRNA的表达和稳定性。

以往的研究表明，YAP1不仅作为转录共激活因子参与Hippo通路，而且作为Wnt/β-连环蛋白信号通路的关键调控因子。KEGG富集分析结果显示，linc02159敲除组中Wnt/β-连环蛋白信号通路显著富集（图6A）。与对照组相比，其表达量有所增加在LINC02159和ALYREF-敲低组中，β-连环蛋白、c-Myc和细胞周期蛋白D1的表达显著降低，而LINC02159的过表达导致了相反的效果（图6B-D）。

过表达ALYREF可以逆转LINC02159敲低导致的YAP1的下调（图6e和S7）敲除LINC02159明显抑制了YAP1的表达以及NSCLC细胞的生长、迁移和侵袭，但这种抑制作用可以逆转（图6G-H）。这些结果表明，LINC01259通过YAP1/β-连环蛋白轴促进NSCLC的进展。

LINC02159与ALYREF的相互作用通过增强YAP1的m5 C修饰，提高了其mRNA的稳定性，增加了其表达，激活了下游的Hippo和β-连环蛋白通路，促进NSCLC细胞的生长和转移。我们的研究结果阐明了LINC02159的生物学作用及其在NSCLC进展中的作用机制，这可能有助于我们更好地研究了解LINC02159在NSCLC发病机制中的作用，并为NSCLC提供了一个很有前途的生物标志物和治疗靶点。

作者使用伯信生物明星产品MeDIP和RIP试剂盒进行了上述分子互作调控机制的研究。