大家好,今天我们继续来聊一聊生物化学中的明星实验——RIP实验(RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay),也就是RNA结合蛋白免疫沉淀实验。这个实验是研究细胞内RNA与蛋白质相互作用的关键工具,为理解转录后调控机制提供了重要线索。
下面是一些常见问题的解答:
不同规格试剂盒,大概能做多少次?
1T就代表1个test,input是提取总RNA作为参考的,1个IP组和1个IgG组各为一个test。参考我们one group说明书,只做IP组一个Test,12T能做12个样本;参考我们two groups说明书,同时做IP和IgG两个test,12T能做6个样本。
RIP实验的IP组和IgG组是不是应该拉不到内参(GAPDH)的?
RIP实验中GAPDH是作为阴性对照基因,而不是作为内参,理论上不会拉下来,实际操作中可能会有非特异结合,只要相对靶基因,富集效率足够低,就可以。
一般IP组提RNA的浓度是多少?
IP组富集结合RNA,本身浓度是比较低的,浓度不作为重要参考指标。样本不同,IP组产物浓度也会有比较大的区别,常见浓度为10~100 ng/ul(RNA产物体积为30ul)。
input、IP、IgG的RNA产物要求等体积逆转录还是等质量逆转录?
input、IP、IgG的RNA等体积逆转录,一般input的浓度最高,按input浓度计算逆转录体积。因为最终要计算的是IP组和IgG组相对于Input的富集效率,所以要保持体积比例不变。同时由于前面裂解液各组体积比Input:IP:IgG=1:8:8,所以计算富集效率过程input的CT值会有一个-3的校正值(log2(1/8))。
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RIP实验有非特异性结合怎么办?
选择高特异性的IP级抗体,优先考虑经过验证的商业化抗体。
洗涤可以剧烈一些,经过洗涤可以将非特异性结合蛋白分子去除,加入试剂后吹打几次或涡旋几秒,也可适当增加洗涤次数,每次洗涤在磁力架去上清后再简单离心,用小枪头将管壁的上清彻底吸除干净,尤其是最后一次,以便能尽量洗掉非特异结合。
非特异结合无法完全避免,只能尽量减少,IP/IgG有显著性差异即可。
RIP实验中为什么需要多次洗涤?
多次洗涤能有效去除非特异性结合的RNA和蛋白质,提高实验的特异性和信噪比。
如何选择合适的抗体进行RIP实验?
需要用IP级或者RIP级抗体,也可尝试ChIP级,一般抗体说明书会有标注,此外也可以参考文献来进行选择和验证。
实验过程中如何防止RNA降解?
全程冰上操作,使用无RNase的耗材和试剂,避免反复冻融;加试剂等操作尽量迅速。
如何判断RIP实验是否成功?
RIP-qPCR结果主要看富集效率%input,和富集倍数fold enrichment,没有明确的阈值要求,IP组的靶基因富集效率显著高于IgG组即为有效富集。
IP产物中靶标RNA含量低,信号弱,如何优化?
增加细胞量,并充分裂解释放细胞内的RNA-蛋白质复合物。同时,尝试调整抗体用量、磁珠孵育时间,以提高IP效率,或尝试优化RNA提取步骤。
RIP-Seq数据如何分析?
对RNA产物质检合格后,进行文库构建(建议先去除核糖体RNA,提高有效数据量),使用Illumina 测序平台进行高通量测序。然后,将测序数据与参考基因组比对,检测结合峰(Peak),预测motif。最后,进行差异Peak分析、功能注释和通路分析等,揭示RNA与蛋白的相互作用网络。
RIP实验中出现假阳性结果的可能原因有哪些?
包括抗体非特异性结合、RNA降解、洗涤不够彻底、实验操作不当等。需通过设置严格的实验条件和对照实验来排除假阳性。
如何评估RIP实验的重复性?
通过多次重复实验,比较不同批次间数据的一致性。同时,可设置技术重复和生物重复来提高实验的可靠性和可重复性。
RIP实验结果如何与其他实验数据相结合?
RIP实验结果可与其他转录组学、蛋白质组学或表观遗传学数据相结合,综合分析RNA与蛋白的相互作用及其在基因表达调控中的作用机制。例如,结合RNA pulldown实验与RIP实验相互佐证;结合ChIP-Seq和ChIRP-Seq数据可以揭示RNA与DNA结合蛋白的共定位情况;结合RNA-Seq数据可以分析RNA结合蛋白对基因表达的影响等。
总结:
RIP实验作为研究RNA与蛋白相互作用的重要工具,不仅可以帮助我们揭示基因表达的调控机制,还为疾病诊断和治疗提供了新的思路。通过掌握实验流程、解答常见问题并注意操作细节,我们可以更好地开展RIP实验,取得更加准确和可靠的研究结果。
希望这篇推文能够帮助到正在或即将进行RIP实验的你!如果你有任何疑问或心得,欢迎在评论区留言交流哦!