FAM50A promotes esophageal squamous cell carcinoma progression via                     splicing-dependent oncogenic circSDK1- and DUSP22-mediated MAPK/FAK activation

《Cell Discovery》（IF=16.904）

摘要

失调的剪接因子在肿瘤进展中起着关键作用。在此，我们鉴定出序列相似性50家族成员A（FAM50A）是一种重要的致癌性剪接因子，参与食管鳞状细胞癌（ESCC）的发生。

多组学和多队列分析显示，FAM50A在 ESCC 中上调，且与不良预后相关。功能研究表明，FAM50A在体外和体内均能促进 ESCC 的增殖和迁移，主要通过激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）和黏着斑激酶（FAK）实现。

我们进一步表征了FAM50A结合的RNA基序，并建立了其全转录组剪接图谱。值得注意的是，我们发现了一种新的FAM50A依赖性反向剪接事件，该事件生成了circSDK1，后者源自侧翼细胞黏附分子1（SDK1）前体mRNA的第2至4外显子。

从机制上讲，circSDK1与双特异性磷酸酶22（DUSP22）结合，占据其磷酸酶结构域，从而抑制DUSP22介导的MAPKs和FAK的去磷酸化，进而维持它们的激活状态。此外，转录因子TFAP2C增加了FAM50A的表达。

最后，我们鉴定出利福布汀作为FAM50A的小分子抑制剂，并在细胞来源的异种移植模型、患者来源的类器官模型及患者来源的异种移植模型中证实了其抗肿瘤效果。

综上所述，FAM50A通过FAM50A/circSDK1/DUSP22轴促进 ESCC 进展，导致MAPKs和FAK激活。使用利福布汀对FAM50A进行遗传或药理学靶向治疗，是一种有前景的 ESCC 治疗策略。

一、研究背景

1.可变剪接（AS）：包括经典线性剪接和反向剪接（产生circRNA），剪接异常是肿瘤恶性表型的重要驱动；剪接因子在实体瘤中常发生表达量改变，是潜在肿瘤治疗靶点。

2. FAM50A：剪接体组分，参与剪接体组装与催化活性；既往报道该基因突变导致X连锁智力障碍；病毒可利用FAM50A重编程宿主剪接；少数报道FAM50A参与肿瘤转移，但FAM50A在肿瘤中调控可变剪接的全局图谱、下游靶RNA、在ESCC中的功能完全不清楚，也无靶向FAM50A小分子抑制剂。

3. ESCC临床痛点：手术、放化疗、免疫治疗后复发风险高，急需新靶点与新药。

二、研究策略

1.发现层（临床驱动）：多队列+临床样本蛋白组筛选 → 发现FAM50A在ESCC高表达，提示不良预后。

2. 功能层（因果确立）：敲低/过表达细胞 + CDX体内模型 → 证明FAM50A促ESCC进展，激活MAPKFAK通路。

3. 组学挖掘层：RIPseq、RNAseq、circseq → 解析FAM50A剪接全景，锁定下游circSDK1。

4. 机制闭环层：circSDK1DUSP22互作、酶活、多重rescue → 阐明FAM50A/circSDK1/DUSP22/MAPKFAK轴；解析上游TFAP2C转录调控。

5. 转化干预层：虚拟药物筛选 + CDX/PDO/PDX临床前模型 → 发现利福布汀靶向FAM50A，和顺铂协同抗肿瘤。

三、结果

第一部分： FAM50A在ESCC中高表达，与不良预后相关

1.生信初筛：对TCGAESCC、GSE53624两个独立队列274个剪接因子做预后分析，得到6个两个队列均提示不良预后的剪接因子。

2. 蛋白组筛选（长海队列Ⅰ，24例ESCC癌癌旁转移淋巴结）：6个里面4个蛋白在肿瘤上调。

3. 多队列蛋白、mRNA：FAM50A在ESCC癌组织、转移淋巴结显著高于癌旁；TCGAEC（ESCC+EAC）同样上调。多组学+多临床队列+功能初筛联合锁定靶点，避免单一数据集假阳性；癌、转移淋巴结同时上调，提示FAM50A不仅参与原发肿瘤，还和转移相关。

第二部分：FAM50A通过激活MAPK、FAK促进ESCC恶性表型

、

 1.FAM50A可以调控肿瘤转移完整链条：EMT（转移启动）→失巢凋亡抵抗（循环播散存活）→胞外基质粘附（远处定植）。

2.体外多种表型+体内CDX互相印证；通路层面将剪接因子FAM50A和经典促转移激酶MAPK/FAK建立联系。

第三部分：FAM50A全转录组RNA结合与可变剪接全景

1.IPMS：鉴定FAM50A互作蛋白。 CoIP内源验证：FAM50A结合HNRNPL、EFTUD2、HNRNPC、DDX41；免疫荧光FAM50A与核斑点标记SC35共定位。

2. RIPseq（FAM50A）： 结合RNA类型：mRNA占79.31%；交联位点大量分布在外显子、内含子区域。

3. rMATS分析经典可变剪接：shFAM50A后共1477个FAM50A依赖的可变剪接事件，外显子跳跃Skipped exon占比最高（65.88%）；发生剪接改变的基因显著富集FAM50A结合峰，说明是直接调控。

4. circRNA转录组：shFAM50A后，137个circRNA上调，154个circRNA下调，亲本mRNA表达不变，说明FAM50A独立调控反向剪接。

5. 蛋白截短实验：构建FAM50A不同截短体Δ1、Δ2、Δ3；RIPqPCR、RNA pulldown证实：C端Domain3（169339aa）是RNA结合必需结构域。

6. 模型验证CRTC1剪接：FAM50A结合CRTC1 premRNA，促进CRTC1外显子3跳跃，产生短转录本CRTC1S；敲低FAM50A则外显子保留，CRTC1L增多，作为经典剪接的阳性对照。

第四部分：FAM50A通过反向剪接产生circSDK1，介导ESCC恶性表型 

1.circRNA筛选策略：4对ESCC癌vs癌旁circRNAseq交集得到候选circSDK1。

2. circSDK1分子特征鉴定：

1）来源于SDK1 premRNA 24外显子，415nt；Sanger测序验证反向剪接连接位点。

2)RNase R、放线菌素D：circSDK1比线性SDK1更加稳定；oligodT反转录几乎检测不到circSDK1；核质分离：circSDK1主要定位细胞质。

3. RIPqPCR（FAM50A截短体）：FAM50A依靠Domain3直接结合SDK1 premRNA的intron1；RNA pulldown野生探针显著富集FAM50A，突变探针结合消失。证明FAM50A直接结合SDK1前体RNA促进反向剪接生成circSDK1。

4. circSDK1单基因敲低表型：抑制增殖、克隆、迁移侵袭、胞外基质粘附，提升失巢凋亡。

5. rescue回补实验

1）细胞层面：shFAM50A抑制增殖、侵袭、降低MAPKFAK磷酸化、诱导失巢凋亡、抑制EMT；过表达circSDK1可以大部分逆转上述表型。

2）体内CDX：shFAM50A抑制成瘤；过表达circSDK1恢复肿瘤生长；IHC/TUNEL显示Ki67、EMT、凋亡表型被回补。

3）对照：过表达线性SDK1不能回补表型，证明功能执行者是circSDK1，不是线性mRNA。

4）反向rescue：FAM50A过表达带来的恶性表型，敲低circSDK1可以抵消，进一步确认FAM50A致癌依赖circSDK1。

第五部分： circSDK1结合DUSP22磷酸酶结构域，抑制DUSP22，维持MAPK/FAK磷酸化

1.排除miRNA海绵、编码多肽：circSDK1无ORF、无IRES；RIPqPCR AGO2富集无差异，排除ceRNA机制，推测circSDK1结合蛋白发挥功能。

2. 候选筛选：双特异性磷酸酶DUSP家族，DUSP22在ESCC显著下调；已有文献DUSP22可以介导MAPK、FAK去磷酸化，作为抑癌基因。

3. 分子互作验证

1） AlphaFold3预测circSDK1结合DUSP22的磷酸酶结构域（Domain2）。

2） DUSP22截短体RIPqPCR：只有含磷酸酶Domain2的片段结合circSDK1；关键氨基酸点突变，结合消失。

3）EMSA体外实验：circSDK1探针与重组DUSP22蛋白直接结合；冷探针竞争实验证明结合特异性。

4） 免疫荧光FISH：circSDK1与DUSP22在细胞质共定位。

4. 酶活实验：体外重组蛋白，circSDK1剂量依赖性抑制DUSP22磷酸酶活性。

5. 功能rescue：过表达DUSP22，逆转circSDK1过表达带来的MAPKFAK高磷酸化、逆转EMT、逆转失巢凋亡抵抗。

第六部分：上游转录因子TFAP2C驱动FAM50A转录上调

1.多数据库TFtarget、JASPAR、ChIPAtlas预测FAM50A启动子转录因子；排除HIF1α（常氧/缺氧均不改变FAM50A），锁定TFAP2C。

2. 双荧光素酶报告：启动子截短，定位响应区域1 ~700bp；定点突变TFAP2C结合位点（163~173），TFAP2C无法激活荧光素酶。

3. ChIPqPCR：TFAP2C蛋白直接结合FAM50A启动子预测位点。

4. 细胞表型：shTFAP2C，FAM50A表达下调，ESCC增殖、迁移侵袭被抑制；过表达FAM50A可以rescue TFAP2C敲低造成的恶性表型下降，证明TFAP2C促癌功能依赖FAM50A。

5. 临床样本：TFAP2C在ESCC上调，TFAP2C表达与FAM50A蛋白水平正相关；多个ESCC队列TFAP2C高表达提示不良预后。

第七部分：利福布汀rifabutin抑制FAM50A，联合顺铂协同抗肿瘤

1.虚拟药物筛选：FDA已上市药物库；基于FAM50A蛋白结构分子对接，筛选得到rifabutin利福布汀；分子动力学模拟，利福布汀FAM50A复合物RMSD稳定，氢键稳定，提示结合稳定。

2. 细胞层面药效 利福布汀处理，可以抑制FAM50A介导的经典可变剪接和反向剪接事件。利福布汀下调FAM50A过表达诱导的MAPKFAK磷酸化；逆转FAM50A介导EMT、失巢凋亡抵抗。

3. 多层次体内/体外肿瘤模型药效

1）CDX细胞来源异种移植：利福布汀单药抑制肿瘤生长；利福布汀+顺铂联合抑制效果显著优于单药；IHC显示联合组Ki67降低，凋亡升高，EMT被抑制。

2）病人来源类器官PDO：联合用药显著降低类器官活力。

3）PDX病人来源异种移植：联合用药显著抑制肿瘤增殖。

创新点

1.证实剪接因子FAM50A是ESCC新的致癌驱动分子与预后标志物；绘制FAM50A全转录组RNA结合图谱、经典可变剪接、circRNA生成调控全景。

2. 揭示剪接因子直接调控反向剪接产生致癌circRNA的完整通路FAM50AcircSDK1DUSP22MAPK/FAK。circSDK1通过蛋白互作抑制抑癌磷酸酶DUSP22，不充当miRNA海绵。

3. 阐明上游转录因子TFAP2C驱动FAM50A异常高表达。

4. 筛选老药利福布汀作为FAM50A小分子抑制剂，在CDX、PDO、PDX多种模型证实单药以及和顺铂协同抗肿瘤，为ESCC靶向治疗提供新思路。

五、局限

1.FAM50A引起大量可变剪接（经典AS+circRNA），本研究仅深度解析circSDK1，其他下游靶分子仍有待挖掘。

2. MAPK、FAK、EMT、失巢凋亡之间复杂交叉调控网络仍需进一步解析。

3. 利福布汀是老药，本研究为临床前结果，尚未开展临床。

七、结论

总之，本研究证实了FAM50A作为一种新型致癌性剪接因子及 ESCC 预后标志物的功能。我们进一步揭示了FAM50A的结合基序及其全转录组结合模式。我们识别出了依赖于FAM50A的典型AS和反向剪接事件。

此外，如图8所示，我们发现FAM50A通过FAM50A/circSDK1/DUSP22轴发挥致癌作用。我们发现TFAP2C可以激活FAM50A的转录，导致其异常上调。最后，使用利福布汀抑制FAM50A可能成为 ESCC 的一种可行治疗方法。

作者使用伯信生物明星产品RNA pulldown、ChIP、RIP试剂盒进行分子调控机制研究。

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