RNA结合蛋白 ( RBPs ) 是一类功能强大且分布广泛的调节因子，约占细胞中编码的所有蛋白质的5%至10%。
目前，大多数 RNA 通过与蛋白质结合形成 RNA-蛋白质复合物而发挥作用。
随着基因时代的到来，RNA相关研究已成为生物学的重要组成部分，在肿瘤、糖尿病、肠炎等慢性疾病等领域已被广泛研究，但对RNA的作用机制仍知之甚少，各种新发现的lncRNA、circRNA与蛋白质相互作用有待进一步研究和发现。
蛋白质与RNA的相互作用是许多细胞功能的核心，如蛋白质合成、mRNA组装、病毒复制、细胞发育调控等。了解它们之间相互作用的分子机制对理解这些生物学过程非常重要。
目前研究RNA-蛋白质相互作用的方法主要分为两大类：
一类是寻找与感兴趣的RNA结合的蛋白质，如RNA pulldown、RAP、ChIRP等；
另一类是找到与感兴趣的蛋白结合的RNA，如RIP、CLIP等。其中RNA pulldown是检测RNA结合蛋白与其靶RNA相互作用的主要技术之一，是近年来研究lncRNA、circRNA与蛋白质相互作用的主要手段。
1.RNA pulldown原理与应用
1.1 RNA pulldown的技术原理：
RNA pulldown技术为研究RNA和蛋白质相互作用的核心技术，该技术利用生物素标记的RNA和链霉亲和素标记的磁珠高效富集及鉴定RNA结合蛋白质（ RBPs ）。
针对目标区域设计生物素标记的特异性RNA探针，并与细胞蛋白提取物孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，经洗脱，得到目的RNA探针-蛋白质复合物，最后采用Western Blot或质谱鉴定蛋白质类型。
1.2 RNA pulldown的实验流程：
RNA pulldown适用于所有的组织或细胞样本，实验操作相对比较简单，其大概实验操作流程如下所示：
1.3 RNA pulldown的技术应用：
RNA pulldown可用于研究lncRNA、circRNA 和mRNA等与蛋白质的相互作用，分析与目的RNA结合的蛋白种类。
RBPs调控mRNA稳定性、lncRNA活性等生物学过程，调节转录和翻译、基因表达和RNA的加工，介导细胞的发育、分化和代谢等生命过程，在健康与疾病中发挥重要的作用。
在很多疾病（如癌症）的发生机制、预测和治疗中，RBPs发挥了重要作用。因此，RPBs逐渐成为研究的热点，而RNA pulldown以其优势也被应用到众多的研究中。
2. RNA pulldown探针
设计RNA pulldown的探针一般先采用体外转录的方式获得目的RNA全长序列，再随机标记生物素（碱基U标记）。也可以对目的RNA全长做分段截短探针，或针对指定蛋白结合区域制备探针。
其中circRNA的RNA pulldown探针设计比较特殊，一般设计生物素标记的circRNA全长序列加一段接头序列。
3. circRNA pulldown
3.1 circRNA pulldown探针的设计
circRNA pulldown探针一般用生物素标记circRNA序列全长+延长一段接头序列。
3.2为什么不能用circRNA接头互补探针来做RNA pulldown
RNA pulldown 的原理是用生物素标记 RNA 模拟目的 RNA 与蛋白直接孵育结合，这就要求探针序列要与目的 RNA 序列一致，用 circRNA 接头互补探针做 RNA pulldown 不符合实验原理。
实验操作上，首先用 circRNA 接头互补探针的目的是拉取内源 circRNA ，但此时孵育温度不确定，与 RNA pulldown 的孵育温度不相符，另外探针-磁珠复合物与细胞全蛋白孵育时才加入 RNase inhibitor ，这就可能导致细胞裂解时内源性的 RNA 就已经降解了，使探针无法与内源 circRNA 结合。
如果已经合成 circRNA 接头互补探针，又不想浪费，建议用 RAP 试剂盒进行尝试实验。
3.3 为何很多文献都用circRNA接头互补探针做circRNA pulldown
最初可能有个别文章把RAP技术写成RNA pulldown产生混淆，导致后来都跟风造成的。
或者有些文章引用 RNA pulldown 试剂盒，但是自行调整了实验条件，这个我们也无法确认。现在这样的文章越来越多，所以需要仔细甄别。
如果已经用 circRNA 接头互补探针做了 RNA pulldown ，建议最好自行洗脱 RNA ，检测 circRNA 富集效率和 circRNA 宿主基因 RNA 的富集效率，验证是否成功捕获目的 circRNA 。
3.4 circRNA 是环状的，做 RNA pulldown 用线性探针，体外孵育蛋白，会不会不被认可？
RNA pulldown 的原理是用生物素标记 RNA 模拟目的 RNA 与蛋白直接孵育结合，这就要求探针序列要与目的 RNA 序列一致，而生物素标记探针只能是线性的，要和 circRNA 序列尽量保持一致，就要求探针序列要在 circRNA 全长基础上延长一段 circRNA 独有的接头序列，来更接近 circRNA 环状的序列。
RNA pulldown 实验是很成熟的，原理也是被公认的，而 circRNA pulldown 这种探针构建方式，文章有很多，不用担心不被认可。
4. RNA pulldown与RAP、ChIRP的主要区别
4.1原理上
RNA pulldown：针对目标区域设计生物素标记的特异性 RNA 探针，并与细胞蛋白提取物孵育，形成 RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，经洗脱，得到目的 RNA 探针结合蛋白质。（即 RNA 探针拉RBPs ）
RAP （RNA Antisense Purification）：通过设计生物素标记目标 RNA 互补探针组，其与链霉亲和素磁珠结合，将目标 RNA 特异性结合的同时，特异性捕获 RNA 结合调控的各种 RNA 及 RNA 结合蛋白质（RBPs）。（即 RNA 互补探针拉目标 RNA 及结合的调控 RNA 和 RPBs ）
ChIRP （Chromatin Isolation by RNA Purification）：通过设计生物素标记 目标 RNA 互补探针组，其与链霉亲和素磁珠结合，将目标 RNA 特异性结合的同时，特异性捕获 RNA 结合调控的 DNA 染色体片段及参与转录调控的 RNA 结合蛋白质（ RBPs ）。（即 RNA 互补探针拉目标核 RNA 及结合的调控 DNA 和 RBPs ）
4.2 探针设计上
RNA pulldown：探针为目的蛋白结合的RNA序列全长，生物素标记。
RAP：探针能与目的 RNA 特异性结合，探针与目标 RNA 序列反向互补，探针长度一般 30-60 bp ，按照序列每间隔 150-200 bp 设计一条探针，制备探针组，生物素标记； circRNA 一般以接头序列设计一条探针。
ChIRP：探针能与目的 RNA 特异性结合，探针与目标 RNA 序列反向互补，因为需要超声打断，探针长度一般控制在 20-25 bp ，按照序列每间隔 150-200 bp 设计一条探针，制备探针组，生物素标记。
4.3 优势及注意事项
RNA pulldown：快速省时，实验只需3h；操作简单，容易上手。体外实验，结合蛋白富集率高，非特异结合风险也较高，质谱建议同时做实验组和阴性对照组，以排除非特异结合蛋白。
RAP：灵敏度较高，稳定性好；结果准确、重复性好。主要研究对象为lncRNA 、mRNA 或circRNA，内源目的RNA表达量最好△Ct值<12，以降低实验风险。
ChIRP：灵敏度较高，稳定性好；结果准确、重复性好；检测快速，操作简单。主要研究lncRNA转录调控机制，内源目的RNA表达量最好△Ct值<12，以降低实验风险。
5. RNA pulldown实验疑问解答
5.1 RNA pulldown试剂盒和RIP试剂盒有何区别？
RNA pulldown和RIP技术都是研究RNA和蛋白相互作用的经典方法。
区别在于RIP是从蛋白出发研究蛋白-RNA 相互作用的技术，是已知一个蛋白，分析与其互作的 RNA ；而 RNA pulldown 是从 RNA 出发研究蛋白-RNA 相互作用，是已知一个 RNA ，分析与其互作的蛋白。
简单来说， RNA pulldown 和 RIP ，前者是已知 RNA 拉蛋白，后者是已知蛋白去拉 RNA 。
RNA pulldown和RIP是分子机制研究中可以用于相互佐证的两个经典技术。
5.2 RNA pulldown的阴性对照探针如何选择？
RNA pulldown 阴性探针一般有 lacZ 探针和目的 RNA antisense 反义链探针两种类型。
lacZ 探针是通用阴性对照探针，是所研究物种中不存在的序列，相当于无义序列。
Antisense 反义链探针相当于目的 RNA 相同长度的突变探针，但是反义链不能完全排除细胞内的同源性，非特异结合风险更高。
一般建议用 lacZ 通用阴性对照探针。
5.3 RNA pulldown实验组和阴性对照组银染没有明显差异，可以进行质谱吗？
pulldown后需要尽量洗涤干净，建议加入洗涤液先用枪吹打混匀后进行摇匀洗涤，磁力架收集磁珠后用小型掌心离心机离心5s再用小枪头将残留液体彻底吸除干净，或者增加洗涤时间。
RNA pulldown是体外实验，非特异性结合风险较高，建议实验组和对照组同时打质谱，以便排除非特异性结合蛋白。
5.4 如果按照 RNA pulldown 说明书的方法提取蛋白，会不会有些微量蛋白提取的比较少？或可以使用强 RIPA 裂解液的方法进行蛋白提取吗？
不可以用强 RIPA 的方法提取蛋白，要用温和的裂解方法，以保证蛋白活性。如果担心裂解效果，可以进行短暂超声促进裂解（超声时裂解液变澄清即可，一般5分钟就可以）。
5.5 如何确定 RNA pulldown 探针用量？
参考我们试剂盒， RNA pulldown 探针用量建议: 1μg/1000nt/Test ，即根据探针长度计算探针用量。
按照说明书的建议用量做，根据结果情况再看是否需要调整探针量。
5.6 很多文章中显示用 RNA pulldown 试剂盒做 RNA 结合 RNA 的实验，我们的试剂盒能否这样做？是否修改一些步骤就可以，比如细胞裂解时加入 RNA 酶抑制剂，后续洗脱 RNA ，用 Trizol 提 RNA ？
做 RNA 与 RNA 结合验证，建议用 RAP 试剂盒。
我们的 RNA pulldown 试剂盒是针对 RNA 结合蛋白研发的，至于 RNA 结合 RNA ，因为没有足够的文献支持，暂时没有针对此实验目的进行研发。
理论上是可行的，需要自行摸索实验条件。
6. 客户引用文献、银染、质谱、WB示例
关于RNA pulldown的文献比较多，以下是一些经典案例可供参考学习：
Article：Long noncoding RNA NEXN-AS1 mitigates atherosclerosis by regulating the actin-binding protein NEXN
Periodicals：The Journal of Clinical Investigation
IF：13.251
Article：Long non-coding RNA NEAT1 mediated RPRD1B stability facilitates fatty acid metabolism and lymph node metastasis via c-Jun/c-Fos/SREBP1 axis in gastric cancer
Periodicals：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research
IF：12.658
Article：Super-enhancer-associated TMEM44-AS1 aggravated glioma progression by forming a positive feedback loop with Myc
Periodicals：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research
IF：11.16
Article：PHGDH Inhibits Ferroptosis and Promotes Malignant Progression by Upregulating SLC7A11 in Bladder Cancer
Periodicals：International Journal of Biological Sciences
IF：10.75
Article：LINC-PINT impedes DNA repair and enhances radiotherapeutic response by targeting DNA-PKcs in nasopharyngeal cancer
Periodicals：Cell Death & Disease
IF：8.469
Article：LncRNA linc00312 suppresses radiotherapy resistance by targeting DNA-PKcs and impairing DNA damage repair in nasopharyngeal carcinoma
Periodicals：Cell Death & Disease
IF：8.469
Article：LINC01133 promotes hepatocellular carcinoma progression by sponging miR-199a-5p and activating annexin A2
Periodicals：Clinical and Translational Medicine
IF：7.915
Article：Circular RNA 100146 functions as an oncogene through direct binding to miR-361-3p and miR-615-5p in non-small cell lung cancer
Periodicals：Molecular Cancer
IF：7.776
Article：Circular RNA 406961 interacts with ILF2 to regulate PM2.5-induced inflammatory responses in human bronchial epithelial cells via activation of STAT3/JNK pathways
Periodicals：Environment International
IF：7.577
Article：A reduced level of the long non-coding RNA SNHG8 activates the NF-kappaB pathway by releasing functional HIF-1alpha in a hypoxic infammatory microenvironment
Periodicals：Stem Cell Research & Therapy
IF：6.832
Article：CircSPI1 acts as an oncogene in acute myeloid leukemia through antagonizing SPI1 and interacting with microRNAs
Periodicals：Cell Death & Disease
IF：6.304
Article：LncRNA USP2-AS1 Promotes Hepatocellular Carcinoma Growth by Enhancing YBX1-Mediated HIF1a Protein Translation Under Hypoxia
Periodicals：Frontiers in Oncology
IF：6.243
Article：Editor's Highlight: lncRNAL20992 Regulates Apoptotic Proteins to Promote Lead-Induced Neuronal Apoptosis
Periodicals：Society of Toxicology
IF：4.181
以上文献期刊原文：RNA pulldown 经典案例文献
RNA pulldown的银染结果图
RNA pulldown的质谱结果案例
RNA pulldown的Western Blot验证结果案例
