LINC00606 promotes glioblastoma progression through sponge miR-486-3p and interaction with ATP11B

《 Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》（IF=11.2997）

背景：

lncrna调节多种癌症的肿瘤发生和发展。我们首次证实了LINC00606在胶质母细胞瘤（GBM）患者标本中显著表达，并与不良预后相关。

这表明LINC00606可能具有调控胶质瘤发生发展的潜力，而LINC00606在GBM中的生物学功能和分子机制仍很大程度上不清楚。

方法：

采用qPCR检测LINC00606和ATP11B在胶质瘤和正常脑组织中的表达，并通过一系列体外和体内实验验证了LINC00606/miR-486-3p/TCF12/ATP11B轴在GBM中的生物学功能。

通过免疫印迹、FISH、RNA下拉、CHIP-qPCR和双荧光素酶报告基因实验，阐明了LINC00606的分子机制。

结果：

我们发现，LINC00606能促进胶质瘤细胞的增殖、克隆扩增和迁移，同时降低细胞凋亡水平。

在机制上，一方面，LINC00606可以海绵化miR-486-3p；miR-486-3p的靶基因TCF12影响LINC00606、PTEN和KLLN的转录起始。

另一方面，它还可以通过与ATP11B蛋白结合，调节PI3K/AKT信号通路，介导胶质瘤细胞的增殖、迁移和凋亡。

结论：

总的来说，LINC00606/miR-486-3p/TCF12/ATP11B轴参与GBM进展的调控，主要通过LINC00606海绵化miR-486-3p并靶向结合，在转录和转录后水平的肿瘤调控中发挥作用。

因此，我们对调控网络LINC00606的研究可能成为一种新的GBM治疗策略。

为了探讨LINC00606在胶质母细胞瘤（GBM）患者中的临床病理和预后意义，为检测LINC00606在临床肿瘤中的表达，我们收集了120例胶质瘤组织和80例正常脑组织标本，并进行qPCR分析。

与正常脑组织相比，LINC00606在神经胶质瘤组织中显著上调。此外，Kaplan-Meier分析显示，GBM患者中LINC00606的高水平表达与预后不良相关。

LINC00606定位于染色体3p 25.3，随后在U251细胞中通过快速5‘和3’ cDNA末端（RACE）扩增检测全长LINC00606。

在比较LINC00606的两个转录本时，我们的结果更好地匹配了转录本变体1的序列信息。

此外，LINC00606在U251和U118中的表达水平显著高于人脑胶质细胞系HEB。因此，我们选择U251和U118细胞系进行后续研究。

此外，FISH结果显示，LINC00606在U251细胞中的表达量更高。

LINC00606在胶质瘤细胞中的生物学功能研究表明，LINC00606表达的降低抑制了细胞增殖并加剧细胞迁移和伤口愈合率。

此外，Annexin V/PI流式细胞术显示，过表达LINC00606的U251细胞的凋亡率明显低于对照组。

为了进一步探索LINC00606在胶质瘤进展中的分子机制，我们确定了它的亚细胞定位，对U251和U118细胞的细胞质和核组分进行QPCR分析，发现LINC00606主要分布在U251细胞的细胞质中，而在U118细胞的细胞质和细胞核中表达几乎相等。

我们使用DIANA Tools数据库分析LINC00606的靶miRNA。

结果表明，miR-210-3p和miR-486-3p可能与LINC00606结合；为了评估LINC00606是否调控pri-miR-486-3p和pre-miR-486-3p的初级转录，我们过表达LINC00606，结果显示，过表达LINC00606并没有改变U251细胞中pri-miR-486-3p或prerdiR-486-3p的表达水平。

此外，RIP显示AGO2与LINC00606和miR-486-3p结合。这些结果表明，LINC00606在转录后水平调控U251细胞中miR- 486-3p的表达。

随后，我们用转染miR-486-3pmimimicNC、miR-486-3p抑制剂和抑制剂NC后，检测了U251细胞中LINC00606的mRNA表达水平。

结果表明，LINC00606海绵化了miR- 486-3p，降低了其在U251细胞中的表达。与U251中的mimic-NC相比，miR- 486-3p显著抑制了LINC00606-WT的荧光素酶活性而miR-486-3p没有影响LINC00606-MUT的荧光素酶活性。

这些结果表明，LINC00606海绵化miR-486-3p调控其在U251细胞中的表达。

为了验证miR-486-3p在神经胶质瘤的预后价值，我们分析了169个胶质瘤患者的生存概率TCGA数据库，这表明高表达miR-486-3p与神经胶质瘤的胶质瘤患者预后更好。

进一步探索miR- 486-3p的生物学功能；GO结果显示，靶基因主要富集于染色质和转录起始阶段，而KEGG结果显示，miR- 486-3p可能主要参与肿瘤通路和PI3K/AKT信号通路，提示miR- 486-3p可能在肿瘤进展中具有表观遗传调控潜力。

在TCGA和GTEx数据库中，只发现在DEGs和TFs的交叉点富集的TCF12；我们选择TCF12作为miR-486-3p的靶基因进行进一步研究。

此外，TCF12在LGG和GBM中高表达以及四种不同亚型中高表达，TCF12在胶质瘤细胞系中的表达水平显著升高。

我们评估了转染miR-486-3p模拟物、模拟NC、miR-486-3p抑制剂和抑制剂NC后TCF12的mRNA和蛋白表达水平。

我们发现，转染miR-486-3p模拟物的U251细胞中，TCF12的mRNA和蛋白表达水平显著降低。荧光素酶报告实验证实TCF16是miR-486-3p的靶基因。

这些数据表明，TCF12是被LINC00606海绵化的miR-486-3p的直接靶基因。我们进行了体外拯救实验来评估LINC00606通过直接海绵化miR-486-3p及其随后的干扰TCF12调控作用。

我们用miR-486-3p mimic和linc00606过表达质粒共转染U251细胞，挽救了TCF12的mRNA和蛋白表达水平。

前期实验结果表明，过表达LINC006006可显著提高U251细胞的增殖能力和集落形成能力，降低了细胞的凋亡率。

我们进一步认为，miR-486-3p参与了调节U251细胞的生物学功能，因为miR-486-3p的表达增加显著降低了增殖和集落形成能力，并显著增加细胞凋亡水平。

GO分析表明TCF12具有dna结合和转录因子活性；因此，我们推测TCF12通过介导基因转录调控肿瘤恶性进展。

CHIP-qPCR结果显示，在U251细胞中，TCF12与LINC00606的启动子区结合。有趣的是，TCF12也与PTEN和KLLN的启动子结合，启动这些基因的双向转录。

我们尝试在U251和U118细胞中过表达PTEN和KLLN，结果显示，过表达PTEN或KLLN后，U251和U118细胞的凋亡水平升高、细胞增殖下降，提示PTEN和KLLN也影响了胶质瘤细胞的活力。

PTEN和KLLN可参与抑制肿瘤发展和调控肿瘤进展。

综上所述，miR-486-3p可以缓解LINC00606的致癌作用，而靶基因TCF12可以调控LINC00606、PTEN和KLLN的转录起始。

为了进一步揭示LINC00606在GBM中的调控机制，RNA下拉及质谱技术筛选了18个结合蛋白作为LINC00606在GBM中发挥肿瘤调控机制的候选蛋白。

ATP11B与神经学或肿瘤学的领域密切相关，因此我们选择ATP11B作为结合蛋白进行研究。

对200个临床样本的分析显示，与正常脑组织相比，神经胶质瘤组织中ATP11B的mRNA表达水平明显降低。

对过表达ATP11b的U251细胞的RIP-seq数据中的双向lncRNA分析发现LINC00606在大脑中比其他长链非编码RNA具有更显著的富集差异。

RNA下拉结果显示，LINC00606的1-1584nt区域是与ATP11B相互作用的主要RNA结合域。我们合成了一种特殊的LINC00606探针，用于RNA纯化（CHIRP）分离染色质。

与NC对照组相比，奇偶探针组LINC00606与ATP11B有结合关系。RIP实验融合了LINC00606和ATP11B之间的关系。

FISH荧光染色结果确定了它们的共定位.为了进一步验证ATP11B和LINC00606之间的结合域，我们构建了每个ATP11B片段的表达质粒，并进行了RIP实验。

ATP11B的所有片段都在一定程度上与LIN00606结合；然而，细胞内的四个片段（I1-I4：在细胞膜内）显示出更强的结合性。

免疫印迹结果显示，转染LINC00606过表达质粒的U251细胞中ATP11B的表达水平明显降低，而转染LINC00606 siRNA的U251细胞中ATP11B的表达水平升高。

这些结果表明，LINC00606与ATP11B相互作用，抑制了其蛋白表达水平。

为了进一步探索ATP11B在胶质瘤细胞增殖和迁移中的作用，我们在U251和U118细胞中敲除了ATP11B或过表达的ATP11B。

根据CCK-8结果，下调ATP11B可上调U251和U118细胞的增殖并增加细胞的迁移能力，同时显著增加了胶质瘤细胞的凋亡；而过表达ATP11B和LINC00606 siRNA的U251细胞的增殖受到明显抑制。

我们通过RNA-seq评估转染pcDNA3.1或OE ATP11B的U251细胞中不同表达的基因。

KEGG富集分析结果与miR-486-3p靶基因非常相似，这些靶基因主要富集于癌症和PI3K/AKT信号通路中，提示ATP11B可能调节PI3K/AKT信号通路，影响胶质瘤的发生发展。

我们用OE ATP11B或siATP11B转染U251细胞，并采用免疫印迹法检测通路蛋白表达水平。

与对照组相比，U251细胞过表达ATP11B后细胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β的表达水平显著降低，PTEN的表达水平显著升高。

此外，在atp11b敲低的U251细胞中，PTEN的蛋白表达水平降低。

统计学分析显示，与对照组相比，过表达LINC00606后，U251细胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-GSK3β/GSK3β的表达水平均有所提高。

在U251细胞中，过表达LINC00606，并在同时过表达ATP11B和敲除LINC00606后表达上调。

如预期的那样，LINC00606与ATP11B之间的相互作用参与了对胶质瘤细胞的生物学行为的控制，并参与了通过PI3K/AKT信号通路调节细胞凋亡率。

为了探索ATP11B在体内的效果，将过表达ATP11B（OE ATP11B）的U251细胞注射到裸鼠体内，构建胶质瘤的体内模型。模型建立1个月后，用PET检测小鼠大脑中18F-FET的表达，以评估肿瘤的发生情况。

与载体组相比，过表达ATP11U251细胞的小鼠大脑中18F-FET的表达明显降低。为了评估LINC00606和ATP11B在胶质瘤发生发展中的作用，我们采用了异种移植裸鼠模型。

OE ATP11B和sh-LINC00606显著降低了小鼠异种移植瘤的重量和体积。与U251细胞的结果一致，sh-LINC00606导致了PTEN表达水平的增加和PI3K/AKT信号通路的抑制。

过表达ATP11B也表现出类似的调控趋势。免疫组化显示，ATP11B过表达或LINC00606敲低导致异种移植瘤中Ki67表达降低，提示体内移植U251细胞致瘤性受到抑制。

未经处理的肿瘤组织的H&E染色显示存在致密的细胞，严重的核异型性，以及更明显的血管生成和坏死。

因此，了解LINC00606和/或ATP11B在胶质瘤中的潜在机制，对未来抑制胶质瘤进展和复发的治疗具有新的意义。

综上所述，我们的研究结果为进一步研究LINC00606和ATP11B在胶质瘤中的分子机制提供了重要线索。

此外，本研究的结果还具有重要的临床意义。我们的研究发现，LINC00606在GBM中高表达，通过体内和体外的实验验证，抑制其表达可阻碍GBM的表达过程。为将LINC00606转化为临床实践提供了强有力的基础。

因此，如果LINC00606的生物制剂可以应用于临床试验，则与之联合治疗靶向药物可改善GBM患者的治疗效果。我们将在未来的研究中进一步探讨这种可能性。

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